基于核糖体工程定向选育ε-PL高产菌株及发酵条件优化

作     者：徐祖伟 

作者单位：江南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘立明;朱莉

授予年度：2022年

学科分类：081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：ε-PL 白色链霉菌 核糖体工程 ARTP诱变 发酵优化 机理解析 

摘      要：ε-聚赖氨酸(ε-PL)是由25～35个L-赖氨酸单体组成的一种天然聚合物,作为一种广谱的抗菌肽在食品、医学、农药等领域有很大的应用潜力。然而,目前利用微生物法生产ε-PL存在生产强度低、发酵周期长、工艺不稳定等问题。因此,如何进一步提高***的合成能力是目前工业化生产面临的重大挑战。为此,本研究采用了核糖体工程与发酵工程相结合的方法,对白色链霉菌(***)进行了复合诱变及发酵过程的控制与优化,有效的提高了菌株生长性能和ε-PL合成能力,并进一步解析了对核糖体工程的作用机理,其主要的研究内容如下:1.基于核糖体工程筛选高产ε-PL的***菌株。首先,确定了新的菌种选育策略,即使用微孔板培养技术并结合酶标仪来快速检测产量。其次,以*** FMME-545为出发菌株,通过常温常压等离子诱变(ARTP)结合核糖体工程选育了一株具有利福霉素抗性的高产菌株*** FMME-545RX,其ε-PL产量达到2.44 g/L,相较于出发菌株提升了105%。之后,进行第三轮ARTP诱变将链霉素抗性引入其中,选育出一株“利福霉素+链霉素双重抗性菌株*** FMME-545RX-S,其ε-PL产量达到了2.88g/L。最后,在5L发酵罐上对其进行补料分批发酵,发酵192 h后ε-PL产量达到33.5g/L,相较于出发菌株提高了50%。2.解析基于核糖体工程的ε-PL高产作用机理。通过对比出发菌株*** FMME-545和突变株*** FMME-545RX-S的菌体生长性能和产物合成能力、菌落形态、转录水平,从这三个方面由表及里的进行分析。首先,通过菌体的比生长曲线和产物的比合成曲线对比分析发现核糖体工程可显著的提高菌体的生长性能和产物的合成能力。其次,从菌落形态的对比分析表明,突变株FMME-545RX-S其孢子成熟的更快,菌丝更为粗壮,形态分化周期更短。最后,从转录水平的差异性对比分析突变株FMME-545RXS其上调基因主要集中在氨基酸代谢、碳代谢和能量代谢这几个模块,对提高菌体的酸耐受能力和增加碳通量至关重要。3.基于发酵条件优化策略提高ε-PL的产量。通过对发酵过程中营养条件与发酵参数的进一步优化,确定了最优的发酵条件为:采用葡萄糖与蔗糖的双碳源发酵策略,发酵过程中最适p H和DO分别为3.80和30%。在此最优条件下,发酵192 h后,ε-PL的产量、生产强度和单位细胞合成能力分别达到了53.0 g/L、6.63 g/(L?d)和0.88 g/g,相比于出发菌株*** FMME-545分别提高了130%、131%和118%。上述研究结果为ε-PL工业化生产提供了有益的借鉴。