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核糖体工程技术选育ε-聚赖氨酸高产菌株

微生物学通报 2016年第12期43卷 2744-2751页

作者：吴光耀陈旭升王靓毛忠贵江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

【目的】利用核糖体工程技术选育Streptomyces albulus AS3-14的链霉素和利福平双重抗性突变株,以提高其ε-聚赖氨酸合成能力。【方法】通过链霉素抗性筛选,获得链霉素抗性的ε-聚赖氨酸产量提高突变株;在此基础上,继续筛选其利福平抗... 详细信息

【目的】利用核糖体工程技术选育Streptomyces albulus AS3-14的链霉素和利福平双重抗性突变株,以提高其ε-聚赖氨酸合成能力。【方法】通过链霉素抗性筛选,获得链霉素抗性的ε-聚赖氨酸产量提高突变株;在此基础上,继续筛选其利福平抗性突变株,实现链霉素和利福平双重抗性ε-聚赖氨酸高产菌选育。【结果】获得的双重抗性高产突变株Streptomyces albulus WG-608的ε-聚赖氨酸摇瓶产量达到3.7 g/L,5 L发酵罐补料分批发酵ε-聚赖氨酸产量达到53.0 g/L,较出发菌株分别提高了42.3%和32.5%。【结论】链霉素和利福平双重抗性选育能够显著提高ε-聚赖氨酸产生菌Streptomyces albulus的产物合成能力。

关键词： ε-聚赖氨酸核糖体工程抗生素抗性酶活力分析补料分批发酵

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核糖体工程与微生物次级代谢产物合成

生物技术通报 2012年第9期28卷 51-58页

作者：蔡成平王远山郑裕国浙江工业大学生物工程研究所、教育部生物转化与生物净化工程中心杭州310014

核糖体工程通过对微生物次级代谢产物合成相关基因表达的两个重要元件——核糖体或RNA聚合酶进行修饰和改造,带来其结构和功能上的改变,进而影响次级代谢产物的合成。因此,向核糖体组成元件中引入特定的突变就能够有效地调节次级代谢产... 详细信息

核糖体工程通过对微生物次级代谢产物合成相关基因表达的两个重要元件——核糖体或RNA聚合酶进行修饰和改造,带来其结构和功能上的改变,进而影响次级代谢产物的合成。因此,向核糖体组成元件中引入特定的突变就能够有效地调节次级代谢产物的合成,通过该技术改造有重要商业价值的工业微生物,提高其次级代谢产物(如抗生素)的合成能力,对于微生物次生代谢产物研发及产业化具有重要的科研与经济价值。

关键词：核糖体工程核糖体 RNA聚合酶次级代谢产物

核糖体工程改造海绵共附生放线菌紫色素的特性

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湖北农业科学 2013年第12期52卷 2900-2906页

作者：周丹燕王广华戴世鲲陈文李翔中国科学院南海海洋研究所海洋生物资源可持续利用重点实验室/广东省海洋药物重点实验室广州510301 中国科学院研究生院北京100049

从西沙海域未鉴定海绵样品中分离到一株命名为SCKA-96.5的放线菌菌株,该菌在海水高氏I号培养基上产生灰白色气生菌丝。16 S rDNA序列分析表明,该菌为链霉菌属放线菌。通过核糖体工程技术获得其变异菌株SCKA-96.5K,该变异株在海水高氏I... 详细信息

从西沙海域未鉴定海绵样品中分离到一株命名为SCKA-96.5的放线菌菌株,该菌在海水高氏I号培养基上产生灰白色气生菌丝。16 S rDNA序列分析表明,该菌为链霉菌属放线菌。通过核糖体工程技术获得其变异菌株SCKA-96.5K,该变异株在海水高氏I号培养基上能稳定地产生可溶性紫色素。对SC-KA-96.5K所产的紫色素进行粗提取及稳定性分析,了解相关理化因素对其稳定性的影响。初步研究结果表明,在波长600 nm处该紫色素具有最大吸光度;热稳定性较好;颜色随pH的变化明显;强氧化剂次氯酸钠对其破坏较大,在弱还原剂中比较稳定;葡萄糖等食品添加剂对其基本没有影响。作为一种潜在的天然色素资源,该紫色素具有一定的工业开发价值。

关键词：海绵共附生放线菌核糖体工程紫色素稳定性

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核糖体工程改良微生物菌种特性的研究进展

科技通报 2012年第11期28卷 77-83页

作者：傅路裘娟萍浙江工业大学生物与环境工程学院杭州310014

核糖体在转录和翻译两个水平上调节相关基因表达,从而调控微生物的次级代谢。核糖体工程通过诱导核糖体结构的改变,从而改变其代谢产物合成的调控系统,达到改良菌株的目的。本文以rplF基因、rpsL基因、fusA基因、rpoB基因为例综述了核... 详细信息

核糖体在转录和翻译两个水平上调节相关基因表达,从而调控微生物的次级代谢。核糖体工程通过诱导核糖体结构的改变,从而改变其代谢产物合成的调控系统,达到改良菌株的目的。本文以rplF基因、rpsL基因、fusA基因、rpoB基因为例综述了核糖体工程的机理及其重要类型;同时通过介绍核糖体工程在抗生素产量提高、新抗生素开发、产酶能力提高、抗逆境能力改善等方面的应用,展示了其在微生物菌种改良方面的最新研究进展。

关键词：核糖体工程菌种改良抗性筛选

放线菌Streptomyces sp. FJ3的核糖体工程改良与活性产物的分离

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微生物学报 2011年第7期51卷 934-940页

作者：海乐黄宇琪廖国建胡昌华西南大学药学院重庆400716

【目的】利用核糖体工程抗性筛选技术,获得有抗菌活性突变株,并对突变株新产生活性物质进行研究。【方法】以三峡库区筛选出的无抗菌活性放线菌野生株为出发菌,通过单菌落挑选与平板划线培养,分离筛选具有链霉素和利福平抗性突变株;通... 详细信息

【目的】利用核糖体工程抗性筛选技术,获得有抗菌活性突变株,并对突变株新产生活性物质进行研究。【方法】以三峡库区筛选出的无抗菌活性放线菌野生株为出发菌,通过单菌落挑选与平板划线培养,分离筛选具有链霉素和利福平抗性突变株;通过摇瓶发酵和对发酵液进行纸片法活性测定,获得抗金葡菌活性突变株;采用高效液相色谱法(HPLC)分析其发酵液组分,通过LC-MS对变化峰进行分析;进行16S rDNA及形态学鉴定。【结果】链霉素和利福平对放线菌菌株FJ3的MIC分别为0.5μg/mL和110μg/mL;在FJ3突变菌株中,共获得24株链霉素突变菌株和20株利福平突变菌株,抗菌活性筛选显示6株具有抗菌活性,其中2株链霉素突变菌株对金葡菌有强抑菌活性,采用Doskochilova溶剂系统纸层析结果表明,该活性物质为一种核酸类抗生素,HPLC和LC-MS显示该活性物质可能为硫藤黄菌素。【结论】利用核糖体工程技术可以改变放线菌的次级代谢,获得具有生物活性的突变株,拓展药源放线菌活性菌株新资源。

关键词：三峡库区放线菌核糖体工程链霉素抗性抗金黄色葡萄球菌活性

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微生物核糖体工程研究进展

微生物学报 2009年第8期49卷 981-986页

作者：谢庶洁肖静徐俊国家海洋局生物遗传资源重点实验室第三海洋研究所厦门361005 厦门大学生命科学学院厦门361005

微生物获得特定类型的抗性突变,不仅反映了其核糖体或RNA多聚酶上相关靶位点结构的改变,也对突变菌株次级代谢产物(抗生素等)的生物合成能力产生深刻影响,因此筛选抗性突变株可作为微生物推理选育的途径之一。"核糖体工程"是利用微生物... 详细信息

微生物获得特定类型的抗性突变,不仅反映了其核糖体或RNA多聚酶上相关靶位点结构的改变,也对突变菌株次级代谢产物(抗生素等)的生物合成能力产生深刻影响,因此筛选抗性突变株可作为微生物推理选育的途径之一。"核糖体工程"是利用微生物的各类抗性突变为筛选标记,高效获得次生代谢产物合成能力提高的突变株的推理育种新方法。本文综述了微生物"核糖体工程"的概念、各类突变的作用机理,并着重介绍组合抗性突变在提高出发菌株次级代谢产物产量方面的应用。

关键词：核糖体工程抗生素抗性次级代谢微生物育种

利用CRISPR-Cas9系统与核糖体工程获得新型可利霉素产生菌

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生物工程学报 2021年第6期37卷 2116-2126页

作者：刘娟娟张妍赫卫清中国医学科学院医药生物技术研究所卫健委抗生素生物工程重点实验室中国医学科学院药物合成生物学重点实验室北京100050 沈阳同联集团有限公司辽宁沈阳110042

可利霉素(Carrimycin,CAM)是将异戊酰基转移酶基因(Isovaleryltransferase gene,ist)导入到螺旋链霉菌中产生的以异戊酰螺旋霉素(Isovalerylspiramycin,ISP)为主组分的抗生素。原工程菌中的ist基因与螺旋霉素(Spiramycin,SP)生物合成基因簇相距较远,且具有两种抗性基因,难以对其进行基因改造,因此需要构建新型CAM工程菌株。文中通过CRISPR-Cas9基因编辑系统靶向切割2个位点,将ist和其正调控基因acyB2通过同源重组插入到SP生物合成基因簇附近且不参与SP合成的orf54基因下游,获得2种无外源抗性基因插入的CAM产生菌54IA-1和54IA-2,经发酵产物检测发现54IA-2菌株中的ISP产量明显高于54IA-1菌株。通过实时定量PCR (Quantitative real-time PCR,qPCR)检测证实54IA-2菌株中ist和acyB2基因以及部分SP生物合成基因的表达量均高于54IA-1菌株。为进一步获得高产菌株,以54IA-2为出发菌株,利用核糖体工程的方法筛选利福平(Rifampicin,RFP)抗性菌株,在RFP浓度为40μg/mL的抗性菌株中,ISP的产量明显提高,最高可达842.9μg/mL,比原始菌株提高约6倍。对其中7株菌的rpoB基因进行测序分析,每株菌的第576位丝氨酸都突变为丙氨酸,在其他错义突变中产量最高的菌株RFP40-6-8在第424位的谷氨酰胺突变为亮氨酸。综上所述,本研究应用CRISPR-Cas9系统成功构建了无任何抗性标记的新型CAM工程菌株54IA-1和54IA-2,并通过核糖体工程技术筛选获得了新型CAM高产菌株RFP40-6-8,为CAM工程菌株的进一步优化改造奠定了基础。

关键词：可利霉素 4″-O-异戊酰基转移酶基因 CRISPR-Cas9系统核糖体工程

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放线菌核糖体工程的发展与应用

生物工程学报 2022年第2期38卷 546-564页

作者：谢运昌姚仕杰李炜单润润吴贵贵童图强陈奇江西师范大学生命科学学院南昌市鄱阳湖湿地微生物资源与利用重点实验室江西南昌330022 安徽医科大学生命科学学院安徽合肥230032

核糖体工程(ribosome engineering)是一项利用靶点位于细菌RNA聚合酶及核糖体功能因子的抗生素诱导细菌产生抗性突变,进而提升菌株次级代谢生产潜能的技术。该方法无需依赖菌株完善的遗传操作体系,可应用于发掘几乎所有放线菌菌株中潜... 详细信息

核糖体工程(ribosome engineering)是一项利用靶点位于细菌RNA聚合酶及核糖体功能因子的抗生素诱导细菌产生抗性突变,进而提升菌株次级代谢生产潜能的技术。该方法无需依赖菌株完善的遗传操作体系,可应用于发掘几乎所有放线菌菌株中潜在的宝贵活性次级代谢产物,并广泛应用于放线菌基因组挖掘和次级代谢产物增产优化。核糖体工程效果显著,迄今为止,已从百余种放线菌菌株中发掘了10余种新结构分子和提升近30种活性次级代谢产物的生产效价。鉴于此,文中从核糖体工程的发展角度出发,对该技术的建立与优化,及其作用机制的阐明进行了系统的归纳与总结;同时也全面分析探讨了该技术在放线菌次级代谢产物开发中的推广应用,以期为核糖体工程的发展完善及放线菌次级代谢产物的综合开发提供借鉴与参考。

关键词：放线菌核糖体工程次级代谢产物基因组挖掘抗生素

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利用核糖体工程选育丙酮丁醇菌提高丁醇产量

生物工程学报 2012年第9期28卷 1048-1058页

作者：陈丽杰商光来袁文杰吴又多白凤武大连理工大学生命科学与技术学院辽宁大连116024

利用核糖体工程技术对丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum L7进行诱变筛选,以获得丁醇高产菌株。使用链霉素诱变*** L7并结合设计的平板转接逐次提高链霉素浓度的筛选路线,获得丁醇产量较高的菌株S3。结果表明,S3丁醇产量为(12.48... 详细信息

利用核糖体工程技术对丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum L7进行诱变筛选,以获得丁醇高产菌株。使用链霉素诱变*** L7并结合设计的平板转接逐次提高链霉素浓度的筛选路线,获得丁醇产量较高的菌株S3。结果表明,S3丁醇产量为(12.48±0.03)g/L,乙醇产量为(1.70±0.07)g/L,相对于原始菌分别提高了11.2%及50%;丁醇/葡萄糖转化率由原始菌的0.19提高到0.22,丁醇生产率达到0.24 g/(L.h),相比提高30.5%;耐受丁醇浓度由原始菌的12 g/L提高到14 g/L;发酵液粘度下降到4 mPa/s,同比降低了60%,利于后续分离工作的进行,降低发酵成本。进一步研究工作表明,S3菌株遗传稳定性良好。因此,核糖体工程技术是一种选育丁醇高产菌株的有效方法。

关键词：核糖体工程丙酮丁醇梭菌丁醇发酵丁醇耐性链霉素