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基于重组酶聚合酶扩增技术的柯萨奇a6型病毒的快速检测方法的建立

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基于重组酶聚合酶扩增技术的柯萨奇A6型病毒的快速检测方法的建立

作者：王凯风南方医科大学

学位级别：硕士

背景和目的:手足口病(HFMD,hand foot mouth disease)是全世界,尤其是在亚太地区流行的病毒性传染病,主要感染5岁以下儿童,严重威胁儿童健康和生命。HFMD由多种病毒导致,主要包括肠道病毒71(EV71 enterovirus 71)型、柯萨奇病毒(CA,coxs... 详细信息

背景和目的:手足口病(HFMD,hand foot mouth disease)是全世界,尤其是在亚太地区流行的病毒性传染病,主要感染5岁以下儿童,严重威胁儿童健康和生命。HFMD由多种病毒导致,主要包括肠道病毒71(EV71 enterovirus 71)型、柯萨奇病毒(CA,coxsakievirus)A16、A4、a6、A10、B3、B5 以及艾克病毒 30 型等。近年来,多项研究表明HFMD的致病病原体谱发生改变,Ca6成为越来越重要的病原体,在全世界范围内已导致多起HFMD暴发。Ca6可以引起重症HFMD病例,并可导致部分重症患儿死亡。Ca6常引起非典型的HFMD,容易导致误诊。HFMD尚无有效治疗药物,针对EV71的CA16的单价以及双价疫苗已进入临床试验阶段。但针对多种病毒的多价疫苗进展缓慢。HFMD主要预防和控制措施是切断传播,对症治疗以减少并发症的出现。加强HFMD的全球流行病学和实验室病原学监测,预测新的暴发疫情将有助于HFMD的预防和控制,而病原体的快速检测则是HFMD有效监测和诊断的关键。重组酶聚合酶扩增技术(RPA,recombinase polymerase amplification)是英国Twist DX公司商业化的新型核酸扩增检测技术,该技术不依赖于昂贵的仪器,在37-42度的恒温条件下可完成对目的基因的扩增和检测,有多种探针可应用于产物检测,大大提高了检测的特异性。另外,其扩增产物也可以进行测序分析,增加了其可核对性。RPA技术可以在20min内实现对病原体的检测,是目前最快速的核酸扩增检测方法,已被广泛用于病原体的快速检测。所以,RPA技术非常适合于传染病暴发现场的快速检测。本研究旨在建立针对Ca6的实时荧光逆转录一步法重组酶聚合酶(RT-RPA,reverse transcription remconbinase polymerase amplification)快速检测方法。方法:在Genbank下载Ca6病毒的VP1蛋白的基因序列,并比对序列寻找保守区。针对保守区设计特异性的引物,进行引物筛选并设计相应的探针,随后建立针对Ca6的实时荧光RT-RPA快速检测方法。将含有目的片段的cDNA连接至载体,并进行体外转录,计算核酸浓度并转换成拷贝数/μ1,随后进行10倍梯度稀释,每个梯度设置8个重复,分别用实时荧光RT-RPA检测和商业化Ca6荧光定量PCR检测试剂盒检测,概率元分析计算其95%检测限。用RT-RPA检测对照病毒,分析其特异度。分别利用RT-RPA和商业化Ca6荧光定量PCR检测试剂盒检测234份EV71和CA16阴性的HFMD病例的粪便样本,分析检测结果一致性,计算Kappa值。结果:RT-RPA检测方法的反应时间为20min。RT-RPA检测方法只与Ca6发生反应,产生扩增曲线,没有与任何对照病毒发生反应,其特异度为100%。RT-RPA的95%检测限低至231拷贝/反应,与商业化荧光定量PCR无差别。临床样本的检测结果显示RT-RPA检测方法与商业化Ca6荧光定量PCR检测试剂盒的kappa值为0.93,pa6的实时荧光RT-RPA具备良好的特异性和灵敏度,反应快速,将有助于Ca6相关的HFMD的监测和诊断。

关键词：柯萨奇病毒A6型重组酶聚合酶扩增快速检测

福州地区2012年柯萨奇a6型肠道病毒分子特征分析

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中国人兽共患病学报 2013年第11期29卷 1124-1126,1130页

作者：陈智伟姚栩陈霄璐谢乃鸿陈艳张晓阳福州市疾病预防控制中心福州350004

目的对2012年福州地区分离的其他肠道病毒CVa6进行分子鉴定，并对其VP1部分序列进化分析。方法肛拭子标本采用RD细胞进行病毒分离，通过RT—PCR对分离株的VP1部分序列进行扩增、克隆和测序；经过Blast程序比对来确定病毒的基因型；通过M... 详细信息

目的对2012年福州地区分离的其他肠道病毒CVa6进行分子鉴定，并对其VP1部分序列进化分析。方法肛拭子标本采用RD细胞进行病毒分离，通过RT—PCR对分离株的VP1部分序列进行扩增、克隆和测序；经过Blast程序比对来确定病毒的基因型；通过Mega4．0软件对不同病毒株VP1部分序列的差异进行比较。结果从10份其他肠道病毒患者的肛拭子标本中分离到6株CVa6病毒。测序结果显示，该6株CVa6病毒核苷酸序列具有高度一致性，但与福州周边国家或地区CVa6的核苷酸一致性为91．8％～97．3％。结论2012年福州市HFMD的病源除Ev71和CVA16外，还包含CVa6病毒。序列分析表明，因此，应加强对手足口病例中其他肠道病原体的检测，并掌握其流行以及病毒遗传进化特征，为HFMD的防控提供科学依据。

关键词：手足口病柯萨奇病毒A6型 VP1基因序列分析

1株柯萨奇病毒A6型河南分离株全基因序列特征分析

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中华流行病学杂志 2012年第11期33卷 1198-1199页

作者：许玉玲黄学勇卫海燕王卫华许汴利河南省疾病预防控制中心传染病预防控制所郑州450016 焦作市疾病预防控制中心

柯萨奇病毒a6（CVa6）属于肠道病毒A组成员，主要引起疱疹性咽峡炎，也可引起手足口病。2011年河南地区从手足口病患者粪便标本中分离到1株CVa6，为了解其基因特征，本研究对分离的CVa6毒株进行全基因序列测定。

关键词：柯萨奇病毒A6型全基因序列

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柯萨奇病毒A组6型所致手足口病研究进展

国际生物制品学杂志 2021年第4期44卷 229-234页

作者：雷富植(综述) 李秀玲(审校) 国药中生生物技术研究院有限公司第二研究室北京101111 上海生物制品研究所有限责任公司 200051

柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus a6,Ca6)是引起疱疹性咽峡炎及手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)的主要病毒之一,临床症状包括广泛性皮疹、迟发性脱皮、脱甲症等。近年来,Ca6感染已成为成人HFMD的主要原因。目前尚无有效治疗CA... 详细信息

柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus a6,Ca6)是引起疱疹性咽峡炎及手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)的主要病毒之一,临床症状包括广泛性皮疹、迟发性脱皮、脱甲症等。近年来,Ca6感染已成为成人HFMD的主要原因。目前尚无有效治疗Ca6感染的药物,但随着关注度的不断提高,相关流行病学和疫苗等方面的研究取得了一定的进展,这些成果将在HFMD的预防和控制中发挥重要作用。此文就Ca6的病原学、分子流行病学、临床特征及疫苗相关的研究进行综述。

关键词：柯萨奇病毒A6型手足口病疫苗

2016—2018年南京地区柯萨奇病毒A6型流行情况及基因特征

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中国预防医学杂志 2023年第10期24卷 1127-1132页

作者：乔梦凯董晓庆王燕闵小雨张洪英丁洁南京市疾病预防控制中心江苏南京210003

了解南京地区手足口病中柯萨奇病毒A6型(Coxsackievirus a6,CV-a6)的流行情况以及VP1区基因特征及3D区的重组形式。收集2016—2018年南京地区手足口病监测样本,使用Real Time RT-PCR方法进行肠道病毒核酸检测,分析流行情况。对CV-a6阳... 详细信息

了解南京地区手足口病中柯萨奇病毒A6型(Coxsackievirus a6,CV-a6)的流行情况以及VP1区基因特征及3D区的重组形式。收集2016—2018年南京地区手足口病监测样本,使用Real Time RT-PCR方法进行肠道病毒核酸检测,分析流行情况。对CV-a6阳性样本针对VP1全长及3D区部分进行基因测序分析,使用Mega 5.2软件进行进化树分析,并使用Bioedit软件进行核苷酸和氨基酸同源性分析。结果显示,2016—2018年南京地区手足口病高发季为5—7月,呈单峰流行。CV-a6阳性690例(41.62%),全部处于D3亚型分支,核苷酸同源性为90.8%~100.00%。CV-a6存在3种重组形式,分别为RF-A、J、L。氨基酸分析显示,在VP1区有13个位点替换,3D区有24个位点替换。CV-a6已取代EV-A71,是南京地区手足口病的优势病原,属于D3亚型;存在3种不同形式的重组。持续开展CV-a6监测,对于南京地区手足口病防控有重要意义。

关键词：手足口病柯萨奇病毒A6型 VP1基因重组形式流行特征基因分型

2013～2014年杭州地区手足口病柯萨奇病毒A6型和A10型VP1基因特征分析

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临床检验杂志 2015年第12期33卷 938-941页

作者：谢国良崔大伟郑书发杨先知余斐陈瑜浙江大学医学院附属第一医院检验科浙江省临床体外诊断技术研究重点实验室杭州310003

目的了解2013-2014年杭州地区手足口病病原谱的分布,并对其病原基因特征进行分析。方法采集2013年3月至2014年4月手足口病患儿标本1 340例,提取病毒核酸,通过逆转录和PCR扩增肠道病毒VP1序列并测序,经Blast比对确定病毒基因型。对柯萨... 详细信息

目的了解2013-2014年杭州地区手足口病病原谱的分布,并对其病原基因特征进行分析。方法采集2013年3月至2014年4月手足口病患儿标本1 340例,提取病毒核酸,通过逆转录和PCR扩增肠道病毒VP1序列并测序,经Blast比对确定病毒基因型。对柯萨奇病毒A6型（CA-a6）和A10型（CA-A10）VP1全长序列进行同源性比对分析,并构建系统进化树。结果1 340例手足口病患儿标本中,肠道病毒检出阳性率为81.43%（1 090/1 340）。其中,CV-a6阳性率为41.04%,取代EV-71（14.48%）成为杭州地区检出阳性率最高的肠道病毒;CV-A10检出率（8.51%）也高于CV-A16（3.81%）,列于第三位。同源性比对及系统进化分析显示,2013-2014年的25株CV-a6病毒核苷酸同源性为89.0%-99.7%,主要分布于G、H基因亚型;15株CV-A10病毒核苷酸同源性为95.3%-99.9%,分布于F、G基因亚型。结论 2013-2014年杭州地区儿童手足口病的主要病原体发生重大变化,CV-a6病毒成为最主要病原,CV-A10病毒也存在潜在威胁,需加强对其他肠道病毒的持续监测和分子特征分析。

关键词：手足口病柯萨奇病毒A6型柯萨奇病毒A10型 VP1基因基因特征

一起由柯萨奇病毒A6型引起的疱疹性咽峡炎暴发疫情调查分析

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传染病信息 2020年第3期33卷 243-245页

作者：初艳慧孔庆征刘潇潇黄艳红乔富宇西城区疾病预防控制中心传染病与地方病预防控制科北京100120

目的了解北京市某中学一起疱疹性咽峡炎暴发疫情的流行特征,为疱疹性咽峡炎的防控提供科学依据。方法对病例开展个案调查,采集咽拭子标本进行检测,采用描述性流行病学方法对疫情的流行病学特征和临床特点进行分析。结果2017年10月11日-1... 详细信息

目的了解北京市某中学一起疱疹性咽峡炎暴发疫情的流行特征,为疱疹性咽峡炎的防控提供科学依据。方法对病例开展个案调查,采集咽拭子标本进行检测,采用描述性流行病学方法对疫情的流行病学特征和临床特点进行分析。结果2017年10月11日-11月2日,北京市某中学累计报告疱疹性咽峡炎病例92例,罹患率2.39%。临床表现以口腔疱疹(92.39%)、咽痛(71.74%)、发热(69.56%)为主。共采集43例病例咽拭子标本进行检测,24例柯萨奇病毒A6型阳性,6例肠道病毒未分型阳性。结论本起暴发疫情是由柯萨奇病毒A6型感染引起,学生交叉上课、共用餐厅等公共场所导致疫情的传播,探索一套适应教育改革后传染病的防控方案势在必行。

关键词：疱疹性咽峡炎柯萨奇病毒A6型暴发

阜阳地区2018-2019年柯萨奇病毒A6型感染手足口病临床特征及病原学分析

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广州医科大学学报 2021年第1期49卷 62-66页

作者：孟献萍汪作琳吴婷阜阳职业技术学院医学检验教研室安徽阜阳236000

目的:分析阜阳地区2018~2019年柯萨奇病毒a6(Cox-a6)型手足口病(HFMD)住院患儿的临床与病原学特征。方法:回顾性分析2018年1月至2019年12月阜阳地区确诊的700例HFMD患儿的临床资料,采用实时荧光定量PCR法对标本进行EV71、Cox-16A、Cox-A... 详细信息

目的:分析阜阳地区2018~2019年柯萨奇病毒a6(Cox-a6)型手足口病(HFMD)住院患儿的临床与病原学特征。方法:回顾性分析2018年1月至2019年12月阜阳地区确诊的700例HFMD患儿的临床资料,采用实时荧光定量PCR法对标本进行EV71、Cox-16A、Cox-a6等分型检测,分析Cox-a6型患儿临床特征、并发症,构建Cox-a6分子进化树。结果:共检出Cox-a6阳性143例(20.43%),其中男性91例(63.64%);年龄3岁以内120例(83.92%);主要症状:皮疹(100%)、发热(97.20%)、咳嗽(42.66%)、扁桃体肿大(38.46%)、精神差(35.66%)、脱屑(36.36%)、脱甲(32.87%)、惊厥(27.27%)、纳差(22.38%);实验室检查结果以白细胞升高(77.62%)、血小板升高(41.26%)、谷草转氨酶升高(21.68%)、肌酸肌酶同工酶升高(34.27%)、C反应蛋白升高(56.64%)、乳酸脱氢酶升高(53.85%)为主;并发症总发生率17例(11.89%),包括病毒性脑炎6例(4.20%)、神经源性肺水肿1例(0.70%)、肺炎3例(2.10%)、心肌炎4例(2.80%)、心律失常2例(1.40%)、循环衰竭1例(0.70%)。分子进化树显示24株流行毒株均分布在E2分支。结论:阜阳地区2018-2019年Cox-a6型HFMD占较高比例,患儿集中在3岁以内,皮疹、发热、咳嗽、扁桃体肿大、脱甲等为主要症状,大多数预后良好,少数可伴病毒性脑炎、循环衰竭等严重并发症;E2亚群是Cox-a6流行优势株。

关键词：手足口病柯萨奇病毒A6型临床并发症病原学

上海市柯萨奇病毒A6型流行株基因进化与选择压力分析

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国际病毒学杂志 2017年第6期24卷 365-370页

作者：张晓玲俞慧菊宋志刚王蔚复旦大学附属公共卫生临床中心上海201508 上海交通大学医学院附属新华医院上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心

目的对上海市柯萨奇病毒A6型（CVa6）流行株的基因进化和选择压力进行分析,为今后手足口病的防治提供理论依据.方法选取美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库中的CVa6参考序列,与2011-2015年上海地区CVa6流行株的VP1基因序列进行比... 详细信息

目的对上海市柯萨奇病毒A6型（CVa6）流行株的基因进化和选择压力进行分析,为今后手足口病的防治提供理论依据.方法选取美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库中的CVa6参考序列,与2011-2015年上海地区CVa6流行株的VP1基因序列进行比对,采用MEGA软件构建进化树;扩增2014-2015年上海地区CVa6流行株的全长基因序列,采用Bioedit软件计算氨基酸置换熵值,用Datamonkey在线软件预测正向选择位点.结果基于VP1基因序列的进化树显示2011-2015年上海地区的CVa6流行株为D3、D6和D7亚型,2014年后为D7亚型.氨基酸置换熵值计算共获得39个熵值＞0.6的位点.选取FEL和IFEL模型分析分别发现3个和4个正向选择位点,VP1的595位和3D区的1 999位为分析获得的共同氨基酸变异位点.结论 2014-2015年,上海地区流行的CVa6属于D7亚型,VP1区未出现显著的基因变异,应继续保持对上海地区CVa6的基因进化趋势研究并密切关注基因变异情况.

关键词：柯萨奇病毒A6型基因进化选择压力