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枝状枝孢霉MD2紫杉醇合成相关候选基因A10182和A10251的超表达分析

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作者：德格中南民族大学

学位级别：硕士

紫杉醇是一种高效的抗癌药物,目前主要从红豆杉中提取,但由于红豆杉资源匮乏导致其药源紧缺。利用内生真菌发酵生产紫杉醇是最有前景的替代途径之一。然而,目前发现的产紫杉醇内生真菌的紫杉醇产量较低,均不具备大规模生产的价值。通过... 详细信息

紫杉醇是一种高效的抗癌药物,目前主要从红豆杉中提取,但由于红豆杉资源匮乏导致其药源紧缺。利用内生真菌发酵生产紫杉醇是最有前景的替代途径之一。然而,目前发现的产紫杉醇内生真菌的紫杉醇产量较低,均不具备大规模生产的价值。通过对真菌紫杉醇代谢途径的定向遗传改造,超表达紫杉醇合成限速酶基因和调控基因是获得紫杉醇高产基因工程菌株的主要途径之一。但目前关于真菌紫杉醇的合成途径及其相关基因知之甚少,因此克隆真菌紫杉醇合成相关基因并明晰其功能,是揭示真菌紫杉醇合成途径以及利用基因工程技术提高真菌紫杉醇产量的关键。本文从产紫杉醇内生真菌枝状枝孢霉md2中克隆候选基因A10182和A10251,并通过超表达技术分析这两个候选基因对枝状枝孢霉md2紫杉醇及其他5种紫杉烷类合成的影响,为后期深入研究候选基因A10182和A10251的生物学功能奠定了基础。取得主要研究成果如下:(1)克隆了候选基因A10182和A10251的DNA全长序列并进行生物信息学分析。候选基因A10182和A10251长度分别为678 bp和906 bp,编码产物分别与Endocarpon pusillum的假定蛋白(GenBank ***007808865.1)和Pseudocercospora muase的假定蛋白(GenBank ***16021.1)同源性最高。A10182和A10251的编码蛋白均为疏水性蛋白,不含有二次跨膜结构和信号肽。A10182的编码蛋白共有225个氨基酸,分子量为24.984 kDa,共有4个α螺旋、10个延伸链。A10251的编码蛋共有301个氨基酸,分子量为33.320 kDa,共有3个α螺旋、1个延伸链。(2)成功构建了候选基因A10182的超表达载体pTFCM-A10182,采用农杆菌介导法转化枝状枝孢霉md2,并通过平板抗性筛选和抗性基因hph的扩增检测,共获得23株A10182-转基因菌株。随机挑取13株转基因菌株进行Southern blot分析,结果表明:13株A10182-转基因菌株的外源基因是以单拷贝方式与宿主染色体DNA整合;随机选择其中3株并采用qRT-PCR技术检测候选基因的表达量,结果表明:与对照菌株(未转基因)相比,3株转基因菌株中候选基因的表达量均增加,其中转基因菌株AC的A10182表达量最高,约是对照的2.0倍。HPLC检测结果表明:与对照菌株的紫杉醇(5.033±0.132μg/g)、10-去乙酰巴卡亭III(15.062±0.304μg/g)、10-去乙酰紫杉醇(4.044±0.089μg/g)、7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(2.387±0.059μg/g)产量相比,A10182-转基因菌株AC的紫杉醇(5.187±0.016μg/g)、10-去乙酰巴卡亭III(20.411±0.335μg/g)、10-去乙酰紫杉醇(4.518±0.091μg/g)、7-木糖-10去乙酰紫杉醇(3.434±0.061μg/g)的产量均有所提高;并且A10182-转基因菌株AC中检测到多烯紫杉醇,产量约为2.709±0.106μg/g。该结果预示超表达候选基因A10182对枝状枝孢霉md2上述紫杉烷类的合成有促进作用。(2)构建候选基因A10251的超表达载体pTFCM-A10251并转化枝状枝孢霉md2,共获得30株A10251-转基因菌株。随机挑选14株转基因菌株进行Southern blot检测,结果表明:4株A10251-转基因菌株AC、AV、AH、AE中的外源基因是以单拷贝方式整合到宿主染色体DNA;qRT-PCR检测结果表明:与对照菌株相比,A10251-转基因菌株AC的候选基因表达量最高,约为对照的2.0倍。HPLC检测结果表明:与对照菌株的紫杉醇(5.033±0.132μg/g)、10-去乙酰巴卡亭III(15.062±0.304μg/g)、10-去乙酰紫杉醇(4.044±0.089μg/g)、7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(2.387±0.059μg/g)产量相比,A10251-转基因菌株AC的紫杉醇(6.022±0.116μg/g)、10-去乙酰巴卡亭III(22.304±0.442μg/g)、10-去乙酰紫杉醇(4.209±0.097μg/g)、7-木糖-10去乙酰紫杉醇(3.378±0.074μg/g)的产量均有所提高;并且转基因菌株AC中检测到了多烯紫杉醇,产量约为1.983±0.094μg/g。该结果预示超表达候选基因A10251对枝状枝孢霉md2上述紫杉烷类的合成有促进作用。

关键词：枝状枝孢霉md2 紫杉醇候选基因超表达分析

枝状枝孢霉md2高效遗传转化体系建立及启动子效率评价

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枝状枝孢霉MD2高效遗传转化体系建立及启动子效率评价

作者：刘博华中科技大学

学位级别：硕士

紫杉醇是一种高效、低毒、广谱的天然抗肿瘤药物，但目前药源紧缺。利用产紫杉醇微生物发酵是解决问题的有效途径之一，但目前存在紫杉醇产量低，难以实现产业化的问题。基因工程技术是提高微生物合成次生代谢物产量的有效手段，其中遗... 详细信息

紫杉醇是一种高效、低毒、广谱的天然抗肿瘤药物，但目前药源紧缺。利用产紫杉醇微生物发酵是解决问题的有效途径之一，但目前存在紫杉醇产量低，难以实现产业化的问题。基因工程技术是提高微生物合成次生代谢物产量的有效手段，其中遗传转化方法和启动子表达效率等是基因工程技术成功的关键因素，本研究对这些关键因素开展了研究，并取得了如下主要研究结果：（1）优化了基因枪介导的枝状枝孢霉md2转化体系的有关参数，建立了高效、稳定的以基因枪介导的枝状枝孢霉md2遗传转化体系。结果表明：在真空度20mg Hg，受体孢子浓度108个/ml，DNA用量0.3μg/枪，轰击压力1350psi，轰击距离7cm时的条件下转化效率最高，获得阳性转化子100±5/μg质粒DNA;（2）比较了真菌紫杉醇合成过程中不同启动子的表达效率，通过分析trpC启动子、gpdA启动子和CaMV35S启动子在枝状枝孢霉md2中调控绿色荧光蛋白（gfp）基因在md2中的表达情况，结果表明启动子CaMV35S的表达效率最低，而真菌源启动子gpdA表达效率最高，是CaMV35S的2.95倍;（3）构建了以高效启动子gpdA驱动紫杉醇合成途径中关键酶10-去乙酰巴卡亭III-10β-乙酰转移酶基因（dbat）的表达载体p1303-PgpdA+dbat，并通过基因枪介导的遗传转化方法，成功实现了在枝状枝孢霉md2中的转化，通过对转p1303-PgpdA+dbat转基因菌株的生物量和紫杉醇产量进行分析，结果表明：紫杉醇的产量较野生菌株提高了1.67倍，而生物量则下降了约10%。以上结果表明，本研究获得了较好的产紫杉醇真菌的高效转化体系和驱动效率较高的启动子，为构建紫杉醇高产的基因工程菌株奠定了基础。

关键词：紫杉醇枝状枝孢霉md2 遗传转化体系启动子效率评价工程菌株

产紫杉醇内生真菌枝状枝孢霉md2的发酵条件优化

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微生物学通报 2013年第6期40卷 1033-1040页

作者：苗莉云张鹏周蓬蓬余龙江运城学院生命科学系山西运城044099 华中科技大学生命科学与技术学院资源生物与生物技术研究所湖北武汉430074 湖北省农业科学研究院经济作物研究所湖北武汉430064

【目的】通过优化内生真菌枝状枝孢霉md2的发酵条件,提高10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)和紫杉醇(Taxol)的产量。【方法】采用单因素试验分析不同的培养基初始pH值、培养温度、摇床转速和培养时间对10-DAB和紫杉醇产量的影响,优化枝状枝孢霉... 详细信息

【目的】通过优化内生真菌枝状枝孢霉md2的发酵条件,提高10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)和紫杉醇(Taxol)的产量。【方法】采用单因素试验分析不同的培养基初始pH值、培养温度、摇床转速和培养时间对10-DAB和紫杉醇产量的影响,优化枝状枝孢霉md2的培养条件;以YES为基本培养基,采用单因素试验和正交试验分析添加苯甲酸钠、苯丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸4种前体物对10-DAB和紫杉醇产量的影响,优化枝状枝孢霉md2的培养基组分。【结果】优化后发酵条件为:在初始pH为5.0的300 mL YES培养基中,添加15 mg/L苯甲酸钠、25 mg/L苯丙氨酸、5 mg/L丝氨酸、15 mg/L甘氨酸,接种1 mL枝状枝孢霉md2的孢子悬液(107 108个孢子/mL),28.0°C、220 r/min发酵培养12 d。在此条件下,枝状枝孢霉md2的生物量、10-DAB和紫杉醇的产量分别为15.5 g/L、471.5μg/L和569.5μg/L,与初始发酵条件相比,分别提高了1.3、3.6和3.4倍。【结论】首次获得了枝状枝孢霉md2生产10-DAB和紫杉醇的较适摇瓶发酵条件,可为进一步放大发酵培养提供参考。

关键词：内生真菌枝状枝孢霉md2 10-去乙酰巴卡亭Ⅲ 紫杉醇发酵条件

枝状枝孢霉md2的候选基因A00981的克隆及转基因菌株的构建

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中南民族大学学报（自然科学版） 2019年第1期38卷 45-49页

作者：张鹏刘盼周兰裴婷甘喆李浩东宋发军中南民族大学生命科学学院生物技术国家民委重点实验室/武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室武汉430074

目的:为揭示真菌紫杉醇合成分子机制.方法:克隆了产紫杉醇内生真菌枝状枝孢霉md2的候选基因A00981,该基因DNA和cDNA序列分别为969 bp和894 bp;其编码蛋白含有298个氨基酸、无跨膜结构和信号肽,与酰基辅酶A脱氢酶(ACAD)具有73%的一致性.... 详细信息

目的:为揭示真菌紫杉醇合成分子机制.方法:克隆了产紫杉醇内生真菌枝状枝孢霉md2的候选基因A00981,该基因DNA和cDNA序列分别为969 bp和894 bp;其编码蛋白含有298个氨基酸、无跨膜结构和信号肽,与酰基辅酶A脱氢酶(ACAD)具有73%的一致性.进一步构建该基因的超表达载体pTFC-A00981,并转化枝状枝孢霉md2,共获得9株转基因菌株.结果:Southern blot分析证明其中5株转基因菌株的外源基因是以单拷贝方式插入.结论:该结果为深入分析超表达候选基因A00981对枝状枝孢霉md2紫杉烷类合成的影响奠定了基础.

关键词：枝状枝孢霉md2 紫杉醇基因克隆转基因菌株

紫杉醇合成相关候选基因A02725的克隆及转基因菌株的构建

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基因组学与应用生物学 2020年第1期39卷 145-150页

作者：刘盼柯友胜周兰德格裴婷甘喆李浩东张鹏中南民族大学生命科学学院生物技术国家民委重点实验室湖北省重点实验室武陵山区特色资源植物种质保护与利用武汉430074

真菌紫杉醇合成相关基因的功能研究是揭示真菌紫杉醇合成机制的关键。为了揭示产紫杉醇内生真菌枝状枝孢霉md2的候选基因A02725对宿主紫杉烷类合成的作用,本研究克隆了候选基因A02725的DNA全长序列(1 524 bp);生物信息学预测结果表明该... 详细信息

真菌紫杉醇合成相关基因的功能研究是揭示真菌紫杉醇合成机制的关键。为了揭示产紫杉醇内生真菌枝状枝孢霉md2的候选基因A02725对宿主紫杉烷类合成的作用,本研究克隆了候选基因A02725的DNA全长序列(1 524 bp);生物信息学预测结果表明该基因编码蛋白为亲水蛋白,含508个氨基酸,无信号肽和跨膜结构,与牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)具有79%的一致性;进一步构建该基因的超表达载体并转化枝状枝孢霉md2,通过抗性筛选以及Southern blot检测,共获得27株转基因菌株,其中5株转基因菌株的外源基因是以单拷贝方式整合。该结果为深入分析超表达候选基因A02725对宿主紫杉烷类合成的影响奠定了基础。

关键词：枝状枝孢霉md2 紫杉醇候选基因转基因菌株

枝霉md2的转录组测序及两个紫杉醇合成相关候选基因的过表达分析

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枝霉MD2的转录组测序及两个紫杉醇合成相关候选基因的过表达分析

作者：刘盼中南民族大学

学位级别：硕士

紫杉醇（Taxol）是临床应用的高效、低毒的抗癌药物。产紫杉醇内生真菌是获取紫杉醇的重要药源途径之一。目前,已有55个属200多株内生真菌被报道可产紫杉醇,但是真菌中紫杉醇产量低且不稳定,尚无一株可应用于产业化生产。基于真菌紫杉... 详细信息

紫杉醇（Taxol）是临床应用的高效、低毒的抗癌药物。产紫杉醇内生真菌是获取紫杉醇的重要药源途径之一。目前,已有55个属200多株内生真菌被报道可产紫杉醇,但是真菌中紫杉醇产量低且不稳定,尚无一株可应用于产业化生产。基于真菌紫杉醇代谢途径的定向遗传改造,构建稳定高产的基因工程菌株是实现其产业化应用的主要途径之一。筛选真菌中紫杉醇生物合成相关基因,并验证其功能,是阐明真菌紫杉醇合成的分子机制以及构建高产工程菌株的关键。本研究分析了枝状枝孢霉（Cladosporium cladosporioides;简称:枝霉）md2的转录组信息,初步推测了枝霉md2的紫杉醇合成途径,获得49个与其紫杉醇合成相关的unigenes;克隆了两个候选基因A05868和A02976,分别对其进行了生物信息学分析,构建其过表达载体及转基因菌株,并分析了过表达这两个候选基因对枝霉md2紫杉烷类合成的影响。主要研究成果如下:1)采用Illumina Hiseq?2500高通量测序技术对枝菌md2的转录组进行测序并进行系统的生物信息学分析。Trinity de novo组装得到16603个unigenes,分别在NR、NT、PFAM、Swiss Prot、GO、KOG和KEGG数据库进行BLAST注释,共有12479个unigenes至少可在一个数据库进行注释,1593个unigenes可被七个数据库进行注释。8425个unigenes可进行GO功能注释,归属到生物过程、细胞成分和分子功能三大类共57个功能组。3350个unigenes可进行KEGG注释,归属到262个KEGG代谢途径。在此基础上,推测了枝霉md2中潜在的紫杉醇生物合成途径及其基因信息,包括参与萜类骨架生物合成的9个unigenes和参与紫杉烷类生物合成的40个unigenes。2)克隆了候选基因A05868,该基因DNA和cDNA序列分别为1425 bp和1260 bp;其编码蛋白包含419个氨基酸,与Pseudocercospora fijiensis CIRAD86的溶血磷脂酸酰基转移酶吞蛋白（lysophosphatidic acid acyltransferase endophilin）有57%的一致性,C端有Bin Amphiphysin RVS（BAR）结构域。进一步构建该基因的超表达载体pTFC-A05868并转化枝霉md2,通过抗性筛选获得14株A05868/md2转基因菌株。采用Southern blot检测各转基因菌株中目标基因的拷贝数,共获得8株外源基因以单拷贝方式插入的转基因菌株。选择其中4株（A05868/md2-A8、B1、B6、C1）进行qRT-PCR分析,发现A05868/md2-B6转基因菌株的候选基因的表达量最高,为对照（未转基因）菌株的3倍（5天）;进一步提取该菌株的紫杉烷类并进行HPLC分析,发现在转基因菌株和对照菌株中未检测到紫杉醇、巴卡亭III、7-木糖基-10-去乙酰紫杉醇和多烯紫杉醇4种紫杉烷类物质;而转基因菌株A05868/md2-B6的10-去乙酰巴卡亭III产量（14.621±0.186μg/g）和10-去乙酰紫杉醇产量（1.564±1.025μg/g）相比对照菌株（18.321±0.045μg/g,3.213±0.063μg/g）分别下降了20.195%和51.323%,该结果初步说明过表达A05868对枝霉md2的10-去乙酰巴卡亭III和10-去乙酰紫杉醇的代谢合成有抑制作用。3)克隆了候选基因A02976,该基因DNA和cDNA序列分别为1685 bp和1518 bp;其编码蛋白包含505个氨基酸,与Fusarium oxysporum的单端孢霉烯3-O-乙酰转移酶（trichothecene 3-O-acetyltransferase）有43%的一致性,C端有转移酶结构域。进一步构建该基因的超表达载体pTFC-A02976并转化枝霉md2,通过抗性筛选获得14株A02976/md2转基因菌株。采用Southern blot检测各转基因菌株中目标基因的拷贝数,共获得10株外源基因以单拷贝方式插入的转基因菌株。选择其中4株（A02976/md2-A6、A8、C1、D8）进行qRT-PCR分析,发现A02976/md2-C1转基因菌株的候选基因的表达量最高,是对照菌株的A02976候选基因表达量的3.2倍（10天）。选择A02976/md2-C1进行HPLC分析,发现在转基因菌株和对照菌株中均未检测到紫杉醇、巴卡亭III和多烯紫杉醇3种紫杉烷类物质。转基因A02976/md2-C1中未检测到10-去乙酰巴卡亭III和10-去乙酰紫杉醇,而对照菌株可检测到;转基因A02976/md2-C1可以检测到7-木糖基-10-去乙酰紫杉醇,其产量

关键词：枝状枝孢霉md2 紫杉醇转录组测序候选基因过表达分析

枝霉md2紫杉醇合成相关候选基因A11450和A02725的超表达研究

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枝霉MD2紫杉醇合成相关候选基因A11450和A02725的超表达研究

作者：柯友胜中南民族大学

学位级别：硕士

紫杉醇是一种广谱、高效、低毒的抗癌药物。产紫杉醇内生真菌是重要的紫杉醇药源之一。但目前发现的产紫杉醇内生真菌存在紫杉醇产量低等问题,尚无法实现其工业化应用。高表达真菌的紫杉醇合成限速酶基因和调控基因,构建紫杉醇稳定高产... 详细信息

紫杉醇是一种广谱、高效、低毒的抗癌药物。产紫杉醇内生真菌是重要的紫杉醇药源之一。但目前发现的产紫杉醇内生真菌存在紫杉醇产量低等问题,尚无法实现其工业化应用。高表达真菌的紫杉醇合成限速酶基因和调控基因,构建紫杉醇稳定高产的基因工程菌株是实现其工业化应用的主要途径之一。但目前真菌紫杉醇合成途径及其相关基因的研究极少,严重限制了高产工程菌株的创建。因此,克隆真菌紫杉醇合成相关基因并研究其功能,已成为利用基因工程技术提高真菌紫杉醇产量的关键。本研究以产紫杉醇真菌枝状枝孢霉(简称:枝霉)(Cladosporium cladosporioides)md2为对象,选取了2个候选基因A11450和A02725,克隆了A02725并对A02725进行了生物信息学分析,分别构建了这两个候选基因的超表达载体,并获得相应的转基因菌株,通过检测转基因菌株中紫杉烷类的合成情况,分析了超表达候选基因A11450和A02725对宿主紫杉烷合成的影响,为深入揭示这两个基因的功能以及高产菌株的构建奠定了基础。本研究的主要结果如下:(1)克隆了候选基因A02725的DNA全长序列并采用多个在线软件对其进行了结构和功能预测。候选基因A02725的DNA全长序列为1524 bp,不含内含子,其编码蛋白与Cercospora zeina的牻牛儿牻牛儿焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)一致性为62%,该蛋白不含跨膜结构,无信号肽,含有聚戊烯基合成(Polypentenyl synthetic)结构域。(2)以pTFCM为基本框架构建了候选基因A11450的超表达载体,采用农杆菌介导法转化枝霉md2,成功获得了A11450-转基因菌株25株。采用Southern blot技术分析转基因菌株中外源基因的拷贝数,并随机选择了三株外源基因以单拷贝方式整合的A11450-转基因菌株4-6、4-19及4-20,QRT-PCR检测候选基因A11450的表达量,然后选取基因表达量相对最高的4-20菌株提取紫杉烷类产物进行了HPLC分析。结果表明,A11450-转基因菌株的10-去乙酰巴卡亭III、巴卡亭III及紫杉醇产量是对照菌株(未转基因菌株)的1.24-1.36倍;说明超表达候选基因A11450可提高枝霉md2 10-去乙酰巴卡亭III、巴卡亭III及紫杉醇的产量。(3)构建了候选基因A02725的超表达载体,采用农杆菌介导法转化枝霉md2,共获得A02725-转基因菌株18株。Southern blot验证候选基因A02725的拷贝数。随机选择三株外源基因以单拷贝方式整合的A02725-转基因菌株7-10、7-14及7-18,并采用QRT-PCR检测候选基因A02725的表达量,结果表明7-18菌株的A02725相对表达量最高。HPLC分析7-18菌株的三种紫杉烷类,结果表明A02725-转基因菌株的10-去乙酰巴卡亭III、巴卡亭III及紫杉醇产量是对照菌株的1.34-1.44倍;说明超表达候选基因A02725可提高枝霉md2的三种紫杉烷类的产量。以上结果初步揭示超表达候选基因A11450和A02725可促进枝霉md2的三种紫杉烷类的合成,为后期通过基因敲除分析以及体外催化功能分析深入揭示这两个基因的功能奠定基础。

关键词：枝状枝孢霉md2 紫杉醇功能基因超表达

产紫杉醇内生菌的筛选及紫杉醇合成候选基因的克隆和分析

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产紫杉醇内生菌的筛选及紫杉醇合成候选基因的克隆和分析

作者：席晓圆中南民族大学

学位级别：硕士

紫杉醇是一种高效抗癌药物,但其药源植物红豆杉资源匮乏,严重限制了紫杉醇在临床上的广泛应用。采用内生真菌发酵法生产紫杉醇被认为是解决紫杉醇药源紧缺最有前景的途径之一。但由于产紫杉醇内生真菌的产量较低和不稳定等问题,尚无一... 详细信息

紫杉醇是一种高效抗癌药物,但其药源植物红豆杉资源匮乏,严重限制了紫杉醇在临床上的广泛应用。采用内生真菌发酵法生产紫杉醇被认为是解决紫杉醇药源紧缺最有前景的途径之一。但由于产紫杉醇内生真菌的产量较低和不稳定等问题,尚无一株产紫杉醇真菌用于工业化生产。筛选出产紫杉醇的真菌菌株,并采用分子育种技术构建紫杉醇稳定高产的基因工程菌株是实现其工业化应用的主要途径,而真菌紫杉醇合成酶类基因的克隆及其功能研究是实现产紫杉醇真菌遗传修饰的前提。本研究通过从红豆杉树皮分离内生菌,并采用HPLC-MS(high-performance liquid chromatography-mass spectra)方法筛选产紫杉醇及前体物的菌株,为产紫杉醇内生菌研究提供了新的菌种资源。同时,以产紫杉醇内生真菌枝状枝孢霉md2(Cladosporium cladosporioides md2,简称枝霉md2)为研究对象,在前期完成其基因组和转录组测序的基础上,筛选与紫杉醇合成相关的候选基因,克隆其DNA全长序列和c DNA全长序列,并采用q RT-PCR方法和Southern blot方法分析了候选基因响应茉莉酸甲酯诱导的表达特征以及候选基因在染色体上的拷贝数;之后,分别构建了两个候选基因的原核表达载体并优化其原核表达条件,分别构建了两个候选基因的真菌表达载体并采用根癌农杆菌介导法转化枝状枝孢霉md2孢子,获得转基因菌株,初步分析了两个紫杉醇合成相关候选基因的功能。本研究取得的成果如下:(1)从红豆杉树皮的内表皮共分离到90株内生真菌,200株内生细菌。经检测发现:2株真菌可产紫杉醇(Taxol)、巴卡亭III(Baccatin III)和10-去乙酰巴卡亭III(10-deacetyl baccatin III,10-DAB);1株真菌可产紫杉醇和巴卡亭III;2株真菌可产巴卡亭III。2株细菌拟产紫杉醇。其中产紫杉醇真菌MHZ-32初步鉴定为拟茎点霉(Phomopsis sp.)。(2)通过同源性分析共找出与紫杉醇合成相关候选基因(Unigene)16个,并克隆得到16个Unigenes的DNA全长序列及其中12个Unigenes的c DNA全长序列。Southern blot分析结果表明,这些基因均以单拷贝数存在于染色体。q RT-PCR分析结果表明,12个Unigenes响应茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,Me JA)诱导表现出不同的表达特征,在诱导30 h范围内,1个Unigene表达量上升,4个Unigenes表达量显著下降,6个Unigenes表达量下降不显著,1个Unigene表达量不稳定,呈现先下降后上升再下降的趋势。(3)分别对Unigene A09801和A03231序列进行了生物信息学分析。Unigene A09801的DNA和c DNA全长为1674 bp,不含内含子,编码557个氨基酸;编码蛋白的相对分子量为61291.8 Da,等电点为5.47,分子式为C2717H4201N743O840S18,编码蛋白为亲水性蛋白,不存在跨膜结构和信号肽,N端含有GMC和FAD(flavin adenine dinucleotide)结构域,C端含有GMC结构域。Unigene A03231的DNA和c DNA全长为918 bp,编码305个氨基酸;编码蛋白的相对分子量为33071.5 Da,等电点为5.69,分子式为C1457H2314N406O448S12,编码蛋白为亲水性蛋白,不存在信号肽,含有2个跨膜结构,N端含有ADH(Alcohol dehydrogenases)short C2和ADH short结构域。(4)完成了Unigene A09801和A03231的原核表达载体构建及其原核表达条件优化。Unigene A09801的较适诱导表达条件为:诱导温度32℃,IPTG剂量1.2 m M,诱导时间4 h。Unigene A03231的较适诱导表达条件为:诱导温度28℃,IPTG剂量0.6 m M,诱导时间10 h。在*** BL21中,Unigene A09801和A03231的表达产物多为可溶性蛋白。该结果为后期Unigene A09801和A03231表达产物的纯化及体外催化功能研究奠定基础。(5)首先构建了真菌表达元载体p元(p Origin,简称p O),然后分别构建了Unigene A09801和A03231的真菌表达载体p O-A09801和p O-A03231。为后期Unigene A09801和A03231的过表达分析奠定了基础。

关键词：紫杉醇枝状枝孢霉md2 生物信息学分析拷贝数真菌表达