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条件性敲除海马与新皮质内GABRG2小鼠的构建及其对学习记忆的影响

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条件性敲除海马与新皮质内GABRG2小鼠的构建及其对学习记忆的影响

作者：郭胜楠宁夏医科大学

学位级别：硕士

目的建立基于Cre/loxp重组酶系统调控的海马和新皮质特异性GABA受体γ2亚基(GABRG2)基因条件敲除小鼠模型,为深入研究海马区和新皮质GABRG2在遗传性癫痫伴热性惊厥附加症(Genetic epilepsy with febrile seizures plus,GEFS+)发生中的... 详细信息

目的建立基于Cre/loxp重组酶系统调控的海马和新皮质特异性GABA受体γ2亚基(GABRG2)基因条件敲除小鼠模型,为深入研究海马区和新皮质GABRG2在遗传性癫痫伴热性惊厥附加症(Genetic epilepsy with febrile seizures plus,GEFS+)发生中的功能作用提供动物模型,评估不同温度条件对小鼠癫痫发作的影响,并进一步探讨该基因对小鼠学习、记忆及认知功能的影响。方法1.将引进的GABRG2转基因小鼠与海马和新皮质特异性表达Cre重组酶工具鼠分别进行繁配和鉴定,然后再将2种小鼠进行杂交并对其子代小鼠的基因型进行鉴定,其子代基因型为GABRG2Cre的小鼠为本研究所构建的海马区和新皮质特异性GABRG2基因条件性敲除小鼠。Real-Time qPCR和Western Blotting技术检测GABRG2基因在小鼠海马和新皮质中的mRNA水平和蛋白质水平的表达情况。2.利用直肠温度探针法建立热诱发癫痫模型,在不同温度条件下分别观察小鼠癫痫发作情况,记录其发作级别、加热过程中跳跃次数、评估温度升高对癫痫发作的影响。利用皮层植入电极法记录脑电,观察小鼠癫痫发作时脑电变化。3.利用Smart 3.0小动物行为学视频采集与分析系统记录对照组和GABRG2基因敲除组小鼠在黑白箱实验(Light/dark box,LDB)、旷场实验(Open field,OF)、新物体识别实验(Novel object recognition test,NORT)、新位置识别实验(Object location test,OLT)、三箱实验(Three-chamber tests,TCT)中的行为学变化,分析小鼠的焦虑、学习、记忆及认知功能。结果1.琼脂糖凝胶电泳实验结果显示,子代小鼠基因型符合GABRG2Cre;Real-Time qPCR和Western结果显示,海马与新皮质特异性GABRG2基因敲除小鼠海马和新皮质中GABRG2基因的mRNA水平和蛋白质水平显著低于对照组。2.热诱发癫痫模型过程中,对照组与GABRG2基因敲除组小鼠相比,实验组小鼠皮层脑电的棘波显著高于对照组;基因敲除组小鼠对热诱导癫痫发作敏感性更高(0.75±0.09vs.0.50±0.06,P敲除小鼠与对照组小鼠相比,其在黑箱中的运动距离(1115.62±283.76 cm vs.1880.53±309.42 cm,P敲除小鼠在黑箱中的运动距离(646.32±106.32 cm vs.1835.27±278.14 cm,P敲除小鼠在37℃和39.5℃时,小鼠在旷场周边运动距离显著高于野生组小鼠(3791.80±630.67 cm vs.1552.63±581.86 cm,P敲除小鼠在旷场中心活动时间显著低于野生型小鼠(13.41±8.16 s vs.53.29±7.31 s,P敲除组小鼠在旷场中总的站立次数显著低于野生组(22.78±5.72 vs.163.47±51.28,P敲除组小鼠和野生组小鼠对左、右两个相同物体均有访问且探索时间无显著性差异(WT:59.27±11.41 s vs.61.39±8.74 s,P>0.05;WT+39.5℃:57.16±7.79 s vs.63.25±9.17 s,P>0.05;GAB

关键词： GABRG2基因条件敲除遗传性癫痫伴热性惊厥附加症认知功能

Smad7条件敲除小鼠肺组织病理性衰老的研究

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Smad7条件敲除小鼠肺组织病理性衰老的研究

作者：石瑶杭州师范大学

学位级别：硕士

随着人口老龄化的速度越来越快,我国已经正式步入老龄社会初期。在过去的几年中,人口老龄化已经成为慢性非传染性疾病最大的风险因素,并且直接导致了衰老相关疾病的发病率和死亡率的不断上升。肺属于衰老较早的组织器官之一,一些呼吸系... 详细信息

随着人口老龄化的速度越来越快,我国已经正式步入老龄社会初期。在过去的几年中,人口老龄化已经成为慢性非传染性疾病最大的风险因素,并且直接导致了衰老相关疾病的发病率和死亡率的不断上升。肺属于衰老较早的组织器官之一,一些呼吸系统疾病如慢性阻塞性肺病(COPD)、肺癌、哮喘和特发性肺纤维化(IPF)的发病都可能与肺组织的衰老密切相关。在本研究中,我们以肺组织条件敲除Smad7小鼠为模型,分析了在肺组织中特异敲除Smad7对肺衰老及肺组织中具有成体干细胞特征的肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)衰老的影响。我们发现条件敲除Smad7小鼠肺组织中与衰老有关的标志物β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)阳性染色的细胞数显著增加,肺组织细胞周期抑制蛋白p21、p16显著升高,纤维化标志物α-SMA(α-smooth muscle actin)以及1型胶原也显著升高。进一步分析表明条件敲除Smad7小鼠肺组织中AECⅡ细胞被p21、p16以及与衰老有关的异染色质灶(SAHF)的标志物HP1γ标记的阳性细胞数显著增加。这些结果提示条件敲除Smad7小鼠的肺组织以及肺泡Ⅱ型上皮细胞发生显著衰老。另外我们还发现条件敲除Smad7小鼠肺组织中细胞因子IL1a、IL4、以及自然杀伤细胞标志物NK1.1的表达显著升高,提示肺特异性敲除Smad7导致肺组织的炎症,这可能是由于肺衰老或肺泡Ⅱ型上皮细胞与衰老有关的分泌表型(SASP)招募免疫细胞的浸润而引起。此外,Smad7作为TGF-β/Smads信号通路的抑制因子,负调节TGF-β/Smads信号通路的活性,我们在条件敲除Smad7小鼠的肺组织中发现TGF-β/Smads信号通路中配体TGF-β1、磷酸化Smad3显著升高,且发现与TGF-β/Smads信号通路相关的R-Smads和Co-Smads的表达升高,这提示我们条件敲除Smad7产生的肺病理性肺衰老表型可能为在肺组织中显著激活了TGF-β/Smads信号通路的活性而引起。

关键词： Smad7 条件敲除肺衰老肺泡Ⅱ型上皮细胞细胞衰老

内皮细胞特异性敲除HRH2基因小鼠动物模型的构建及鉴定

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内皮细胞特异性敲除HRH2基因小鼠动物模型的构建及鉴定

作者：孟睿昆明医科大学

学位级别：硕士

目的:前期研究表明组胺H2受体（HRH2）在包括消化系统、中枢神经系统和心血管系统等全身组织中大量表达并广泛参与各相关系统疾病的发生和进展。近期,包括本课题组在内的研究进一步发现,HRH2在血管内皮细胞表达并很可能在一定程度上调... 详细信息

目的:前期研究表明组胺H2受体（HRH2）在包括消化系统、中枢神经系统和心血管系统等全身组织中大量表达并广泛参与各相关系统疾病的发生和进展。近期,包括本课题组在内的研究进一步发现,HRH2在血管内皮细胞表达并很可能在一定程度上调控了心肌纤维化和心脏重构过程。此外,内皮细胞中HRH2还被发现可能在心肌缺血/再灌注损伤、人颅动脉松弛、葡萄糖运输和神经胶质瘤的生长等病理生理过程发挥重要作用。因此,深入研究内皮细胞中HRH2的生物学功能尤为重要。然而,现有的动物模型仍不足以阐明内皮细胞中HRH2的功能。本研究拟构建内皮细胞特异性敲除HRH2小鼠模型为深入研究内皮细胞中HRH2的生物学功能以及其在调控相关疾病病理生理过程中的作用提供合适的动物模型。方法:本研究利用ES打靶,蛋白印记和Cre-LoxP条件敲除等分子生物学技术以及免疫荧光等形态学手段构建并鉴定Hrh2flox/+和Hrh2ECKO小鼠。1.通过将HRH2重要编码区域外显子2两侧内含子置入LoxP位点进行特异性修饰的靶向载体电穿孔至胚胎干细胞,利用显微注射技术将胚胎干细胞注射入C57BL/6J囊胚并植入假孕雌性小鼠以获得Hrh2flox/+小鼠。2.利用Hrh2flox/+小鼠与内皮细胞特异性表达Cre的Cdh5-Cre小鼠杂交繁殖得到内皮细胞HRH2特异性敲除小鼠Hrh2ECKO。***,Western blot和免疫荧光验证内皮细胞组胺H2受体敲除情况。4.对Hrh2flox/+小鼠,Hrh2ECKO小鼠生育率,新生小鼠雌雄分布以及小鼠生长发育情况进行统计。结果:1.酶切电泳鉴定靶向载体符合预期设计要求。PCR、Sourthern鉴定得到10株阳性克隆胚胎干细胞。***测定新生小鼠基因型,记为F0代,共有6只新生F0代小鼠基因型符合要求。***测定内皮细胞特异性表达Cre酶小鼠与Hrh2flox/+小鼠杂交繁殖后代基因型,共有5只小鼠被鉴定为Hrh2ECKO内皮细胞特异性敲除HRH2小鼠,符合要求。*** Blot测定Hrh2ECKO小鼠心脏HRH2表达量略低于野生型小鼠,内皮组织中几乎无HRH2的表达。5.免疫荧光测定Hrh2ECKO小鼠心、肾组织,仅在内皮细胞表达区域无HRH2免疫阳性信号。6.对Hrh2flox/+小鼠,Hrh2ECKO小鼠生育率,新生小鼠雌雄比例以及体重生长情况测定,两品系小鼠分别与野生型小鼠相比均无明显差异。结论:本研究成功构建了Hrh2flox/+小鼠及内皮细胞特异性敲除HRH2的转基因Hrh2ECKO小鼠。两品系小鼠外观表型无异常,能正常种系繁殖,生育率、生长发育与野生型小鼠无明显差异。相关工作将为后续进一步研究包括内皮细胞在内的全身各组织、细胞中HRH2新的潜在生物学功能提供更为可信的实验模型。

关键词： HRH2 条件敲除内皮细胞 Cre-LoxP系统

THAP11通过调控缬氨酸代谢维持造血干细胞功能的作用研究

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THAP11通过调控缬氨酸代谢维持造血干细胞功能的作用研究

作者：王琪安徽医科大学

学位级别：硕士

物质代谢在调控干细胞增殖分化中发挥重要作用。糖代谢与脂肪酸代谢在造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)功能调控中的作用已经有广泛报道,而氨基酸代谢与HSCs的关系尚未得到全面揭示。研究报道HSCs的功能维持依赖特定氨基酸如... 详细信息

物质代谢在调控干细胞增殖分化中发挥重要作用。糖代谢与脂肪酸代谢在造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)功能调控中的作用已经有广泛报道,而氨基酸代谢与HSCs的关系尚未得到全面揭示。研究报道HSCs的功能维持依赖特定氨基酸如缬氨酸、亮氨酸及天冬氨酸等,但在HSCs中这些特定氨基酸如何被调控,尚不清楚。THAP11是转录因子THAP(Thanatos associated protein,THAP)家族成员,控制一系列重要的生物学过程。THAP11可以调控小鼠胚胎的着床、小鼠心脏的早期发育、斑马鱼胚胎颅面发育及视网膜发育等过程。我们实验室前期研究发现在人的脐带血CD34细胞中敲低Thap11,体外成集落能力、体内移植重建能力降低,表明THAP11调控人HSCs功能。Ronin是THAP11在小鼠中的同源基因,前期我们采用Vav-i Cre工具小鼠制备Thap11在小鼠造血系统特异敲除的Vav-i Cre;Thap11小鼠模型,发现Thap11特异敲除可导致胚胎因贫血发生死亡,红系发育障碍,HSCs功能障碍,说明THAP11对造血系统发育至关重要。为进一步揭示THAP11在成体HSCs中的作用,我们制备了在成体造血系统中可诱导敲除Thap11基因的小鼠模型Mx1-Cre;Thap11。本课题利用该模型深入研究了Thap11基因对小鼠成体HSCs功能的影响及其可能的作用机制。本研究结果显示,Mx1-Cre;Thap11小鼠经5次poly(I:C)注射后可有效敲除造血细胞中Thap11基因,敲除小鼠表现为死亡增加,全血细胞及骨髓细胞数量减少,HSCs体外成集落能力及造血重建能力下降。制备Mx1-Cre;Thap11小鼠骨髓细胞移植的嵌合小鼠,8周后注射poly(I:C),也表现为外周血及骨髓中供体细胞减少。分选Mx1-Cre;Thap11小鼠c-Kit细胞,在体外进行IFN-α诱导敲除,发现敲除组细胞体外成集落能力降低,体内重建能力丧失。以上结果表明Thap11的缺失会引起HSCs功能障碍。对THAP11调控HSCs功能的作用机制进行研究发现,Thap11缺失后HSCs中线粒体功能相关基因、自噬相关基因以及氨基酸代谢相关基因表达下调。利用靶向线粒体、自噬的小分子化合物以及特定氨基酸及代谢产物,对体外诱导敲除Thap11基因的c-Kit细胞进行处理,进行成集落能力检测。结果显示,缬氨酸代谢通路产物可以部分挽救敲除Thap11基因造血细胞的体外成集落能力缺陷。为进一步评估缬氨酸代谢通路产物的挽救效果,我们对Mx1-Cre;Thap11小鼠骨髓细胞移植的嵌合小鼠进行缬氨酸代谢产物处理,结果显示缬氨酸代谢产物组合可以提高嵌合小鼠骨髓HSCs数量,增强HSCs二次移植能力。以上结果显示THAP11通过调控缬氨酸代谢通路部分影响HSCs功能。

关键词： THAP11 条件敲除造血干细胞缬氨酸代谢

造血系统缺失Ronin基因降低胎肝细胞救治急性放射病的能力

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军事医学 2019年第10期43卷 721-726页

作者：杨小玉赵珂刘金芳高慧英陈慧詹轶群杨晓明李长燕安徽医科大学合肥230032 军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所北京100850 军事科学院军事医学研究院生命组学研究所北京102206

目的研究造血系统特异敲除Ronin基因缺失后对胎肝细胞救治急性放射病能力的影响。方法利用基因组PCR和Western印迹鉴定Ronin的特异性敲除胚胎。8周龄CD45.1+C57BL/6J小鼠经60Co照射后,移植E14.5 d的野生型或敲除Ronin的小鼠(CD45.2+)胎... 详细信息

目的研究造血系统特异敲除Ronin基因缺失后对胎肝细胞救治急性放射病能力的影响。方法利用基因组PCR和Western印迹鉴定Ronin的特异性敲除胚胎。8周龄CD45.1+C57BL/6J小鼠经60Co照射后,移植E14.5 d的野生型或敲除Ronin的小鼠(CD45.2+)胎肝细胞。移植后不同时间点检测受体小鼠存活率和体质量,并在移植后40 d分析外周血嵌合率。结果造血系统条件敲除Ronin基因后,胎肝细胞救治急性放射病的能力明显降低。结论Ronin是调节胎肝造血干细胞功能的关键因子,该研究为深入探讨Ronin基因在早期造血功能调控中的作用提供了实验模型。

关键词： Ronin基因条件敲除造血系统移植急性放射病

中枢神经系统TauT基因敲除大鼠的构建及对线粒体DNA氧化损伤影响

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中国比较医学杂志 2021年第8期31卷 38-47页

作者：夏一鸣黄晓玲仝慧慧齐浩铭莫丽冬王辰范维佳黄慧玲天津医科大学天津300070 天津市环湖医院天津市神经外科研究所天津市脑血管与神经变性重点实验室天津300350

目的利用CRISPR/Cas9和Cre-loxP技术相结合构建牛磺酸转运体(taurine transporter,TauT)在中枢神经系统中条件性敲除大鼠,并对其脑组织线粒体mtDNA及线粒体呼吸链酶活性进行初步研究。方法利用CRISPR/Cas9和Cre-loxP技术获得TauT基因第... 详细信息

目的利用CRISPR/Cas9和Cre-loxP技术相结合构建牛磺酸转运体(taurine transporter,TauT)在中枢神经系统中条件性敲除大鼠,并对其脑组织线粒体mtDNA及线粒体呼吸链酶活性进行初步研究。方法利用CRISPR/Cas9和Cre-loxP技术获得TauT基因第5外显子两端含有loxP位点的杂合子大鼠(TauT^(loxP/WT))。将获得的TauT^(loxP/WT)大鼠与Nestin-Cre大鼠交配,经繁殖和鉴定最终获得神经特异性TauT基因敲除大鼠(TauT^(loxP/loxP/Cre+))。通过Real-time PCR、Westen blot、免疫组化对TauT^(loxP/loxP/Cre+)大鼠进行基因和蛋白表达检测,用HE染色观测其脑组织形态,并对脑组织mtDNA拷贝数和线粒体呼吸链酶(Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ/Ⅴ)活性进行检测。结果与野生型大鼠相比,TauT^(loxP/loxP/Cre+)大鼠脑组织中TauT基因和蛋白表达显著降低,TauT基因在中枢神经系统被成功敲除,模型构建成功;HE染色显示TauT^(loxP/loxP/Cre+)大鼠脑细胞数量和密度有所降低,而老年TauT^(loxP/loxP/Cre+)大鼠脑中细胞病变更加明显。此外,与野生型大鼠相比,TauT^(loxP/loxP/Cre+)大鼠脑组织线粒体呼吸链复合酶Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ酶活性显著降低,但mtDNA拷贝数却明显上升。结论利用CRISPR/Cas9和Cre-loxP技术成功了构建中枢神经系统TauT基因敲除大鼠模型,并初步验证了此模型对脑组织及其线粒体呼吸链酶和mtDNA的影响,为研究牛磺酸及TauT对脑组织的分子机制提供了新的模型平台。

关键词： TauT基因条件敲除 CRISPR/Cas9 Cre-loxP 大鼠线粒体

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Ronin调控造血干细胞功能与机制研究

Ronin调控造血干细胞功能与机制研究

作者：杨小玉安徽医科大学

学位级别：硕士

THAP11是THAP转录因子家族的成员,广泛参与多种生物学过程。Ronin是THAP11在小鼠中的同源基因,DNA序列同源性高达83%。据报道Ronin通过与转录辅助因子结合调控基因特异性表达,进而影响胚胎干细胞干性维持、线粒体电子传递链以及细胞代... 详细信息

THAP11是THAP转录因子家族的成员,广泛参与多种生物学过程。Ronin是THAP11在小鼠中的同源基因,DNA序列同源性高达83%。据报道Ronin通过与转录辅助因子结合调控基因特异性表达,进而影响胚胎干细胞干性维持、线粒体电子传递链以及细胞代谢等生理过程。Ronin全身性敲除的小鼠胚胎在E7.0天时发育停滞,在心脏特异敲除Ronin则会导致小鼠心脏发育不全并且功能障碍,视网膜细胞条件敲除小鼠视网膜发育障碍以及斑马鱼Ronin缺失后导致颅面发育畸形等,表明Ronin对于多种器官的发育至关重要。但Ronin在造血系统中的研究尚未有报道,我们实验前期发现THAP11调节红系与巨核系分化平衡,并且发现在人CD34细胞中敲低THAP11导致体内重建造血能力降低。在造血系统特异敲除Ronin导致小鼠胚胎期死亡,表明Ronin对小鼠胚胎造血系统发育具有重要调控作用。本研究利用Ronin条敲(Ronin conditional knockout,Ronin CKO)小鼠模型系统评估了Ronin对胚胎造血的调控作用。首先通过分析E13.5-E15.5天小鼠胚胎外周血红细胞数量、血红蛋白含量、红系发育标记物、红细胞脱核情况以及检测胎肝中红系相关基因表达等,明确Ronin对胚胎红系造血的影响。其次通过流式细胞术分析造血干/祖细胞及其他谱系的分布情况;利用集落形成实验检测Ronin CKO小鼠胎肝造血干细胞(HSC)体外功能,同时进行竞争、非竞争移植实验与救治急性放射病模型评估Ronin CKO小鼠胎肝造血干细胞体内功能;通过流式及Seahorse XF分析仪等检测Ronin CKO小鼠造血干细胞的细胞周期、凋亡、线粒体能量供应能力以及ROS情况。最后利用RNA-Seq检测Ronin CKO胎肝Linsca1c-kit(LSK)细胞中基因表达变化,并整合人CD34细胞中THAP11ChIP-seq数据,预测Ronin调控造血干细胞功能的机制。本研究结果显示,造血系统缺失Ronin可导致小鼠胎肝红细胞数量明显减少、血红蛋白含量降低、红细胞脱核比例降低以及红系相关基因表达明显下调,表明贫血是胚胎死亡的直接原因,同时发现红系发育R3期数量明显降低,表明红系发育阻滞在R3时期。进一步发现Ronin CKO小鼠胚胎中全谱系血细胞减少,LSK细胞比例和数量增多,多能祖细胞(Multipotent progenitors,MPP)数量增多,而造血祖细胞(Hematopoietic progenitor cells,HPC)以及各定向祖细胞(CMP,GMP,MEP等)均数量降低,表明Ronin调控小鼠造血干祖细胞发育。对胎肝HSC功能分析发现,Ronin缺失后小鼠胎肝HSC细胞体外集落形成能力明显降低、体内重建造血能力丧失,救治急性放射病的能力明显降低,说明Ronin CKO小鼠胚胎HSC功能严重障碍。此外,我们分析细胞周期发现,Ronin CKO小鼠胚胎LSK细胞G0/G1期比例减少,S期比例明显增多,G2/M期比例减少,表明Ronin参与调控小鼠胎肝HSC的细胞周期。Ronin CKO小鼠胎肝造血干祖细胞呼吸方式偏向糖酵解、最大呼吸能力明显降低并且备用呼吸能力为0,表明Ronin调控小鼠胎肝HSPC细胞线粒体功能,ROS检测发现Ronin缺失后胎肝LSK细胞ROS量明显增多。Ronin条敲后LSK细胞基因表达差异主要集中在细胞周期、线粒体、甲基化调控、乙酰化以及造血作用相关基因等。将小鼠LSK细胞RNA-seq数据与ChIP-seq(人CD34细胞、小鼠ES细胞等)数据整合分析发现,THAP11(Ronin)作为转录因子结合的DNA序列高度保守,高通量测序结果分析Ronin富集结合序列为-CTGGGAYKTGTAGT-(Y为G或A,K为T或A)。综上,Ronin是小鼠胚胎造血发育过程中必不可少的转录因子,可通过染色体上特异结合位点调控多种造血干细胞发育基因的表达。

关键词： THAP11 条件敲除转录因子造血干细胞胚胎造血

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GEFT在心脏中的功能研究

GEFT在心脏中的功能研究

作者：李佑锋湖南师范大学

学位级别：硕士

心脏作为人类最早发育完成的器官,在整个生命过程中发挥重要作用。心脏的发育与形成取决于其细胞增殖、迁移、死亡和分化在时间和空间上的精确调控。其发育过程涉及一系列调控因子和相关信号通路,这些基因的突变或者异常表达都会导致心... 详细信息

心脏作为人类最早发育完成的器官,在整个生命过程中发挥重要作用。心脏的发育与形成取决于其细胞增殖、迁移、死亡和分化在时间和空间上的精确调控。其发育过程涉及一系列调控因子和相关信号通路,这些基因的突变或者异常表达都会导致心脏发育异常。小G蛋白亚家族Rho-GTP酶包括RhoA,Rac1和Cdc42等,它们在真核细胞的细胞进程中发挥广泛作用,如:维持细胞正常生长、增殖、分化、基因调控和细胞命运的决定等。Rho-GTP酶的激活是通过将其结合的GDP转换为GTP而实现,该过程通过特异性的鸟嘌呤核苷酸转换因子GEFs调控。GEFT属于一种鸟嘌呤核苷酸转换因子,能够特异性激活Rho-GTP酶。GEFT是在兴奋性组织如心脏和骨骼肌中广泛表达的一种鸟嘌呤核苷酸转换因子。已知其在许多细胞进程过程中发挥重要调控功能。但是,GEFT在体内的功能并不清楚,因此本实验室构建了基于Cre介导的GEFT在心脏中特异性条件敲除小鼠。GEFT条件敲除小鼠心脏表型正常,表明GEFT对于小鼠的心脏发育是非必须。但是GEFT心脏特异性敲除小鼠在异丙肾上腺素刺激后易于心肌肥大,表明GEFT条件敲除小鼠可能失去了部分抑制心肌病理性肥厚的功能。通过western-blot分析发现Cdc42在GEFT心脏特异性敲除小鼠的心脏中的表达受到轻微的抑制,然而在异丙肾上腺素刺激后该抑制变得较为明显。此外通过对心肌肥厚的相关分子进行RT-PCR,发现GEFT心脏特异性敲除小鼠在病理刺激中p21、SRF和ANF等肥大相关基因出现明显表达差异。我们进一步通过荧光报告系统分析证明p21-luc、ANF-luc、3TP-luc和BRE-luc都能够被GEFT蛋白的表达明显抑制。这些结果共同表明GEFT基因敲除小鼠在异丙肾上腺素刺激后易于心肌肥厚与p21的上调和CyclinA的下调相关,并且还可能涉及其他一些信号通路,如TGF-β信号通路。本文是首次对GEFT在体内的功能进行研究,并探寻了其下游作用机制。

关键词： Rho-GTP酶鸟嘌呤核苷酸转换因子条件敲除心肌肥大 GEFT基因

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mTOR在小鼠听觉系统中的功能研究

mTOR在小鼠听觉系统中的功能研究

作者：杨丽丽山东大学

学位级别：硕士

mTOR是哺乳动物雷帕霉素的靶蛋白（mammalian target of rapamycin）,是PI3K相关激酶（PIKK）家族中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。它是一种调控蛋白翻译起始阶段的蛋白激酶。mTOR是在哺乳动物中极为保守,几乎在所有细胞类型中都有表达,其... 详细信息

mTOR是哺乳动物雷帕霉素的靶蛋白（mammalian target of rapamycin）,是PI3K相关激酶（PIKK）家族中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。它是一种调控蛋白翻译起始阶段的蛋白激酶。mTOR是在哺乳动物中极为保守,几乎在所有细胞类型中都有表达,其编码的蛋白大小为289KD。mTOR在细胞中以两种不同的复合物形式存在,mTORC1和mTORC2。mmTORC1驱动多种合成代谢途径,包括蛋白质合成,核糖体生成,脂肪生成和核苷酸合成,所有这些对于细胞和组织生长都很重要。mTORC2主要在肌动蛋白细胞骨架,细胞存活等方面发挥着重要的作用。研究表明,mTOR信号通路可导致许多重大疾病,如癫痫、糖尿病、结节性硬化综合征和肿瘤等。然而,mTOR在听觉系统中的作用目前并不清楚。本课题的研究目的是研究mTOR在听觉系统中的作用,为听觉发育相关疾病提供动物模型,为其预防和治疗提供科学依据。利用Cre-LoxP条件敲除技术,本研究建立了 Atoh1-mTOR基因敲除小鼠模型。通过研究mTOR基因敲除小鼠的表型变化,我们探索了 mTOR在听觉系统中的功能。使用耳蜗切片免疫荧光染色来确定mTOR在耳蜗上皮细胞中的定位,结果表明,mTOR定位于毛细胞的核周,而且内毛细胞的表达量高于外毛细胞。在本研究中,听觉脑干反应（ABR）用于检测小鼠的听力变化,发现mTOR基因敲除小鼠在出生后30天（P30）,与野生型鼠相比,听阈没有显著变化,但在出生后45天（P45）左右发生严重的听力损失。通过DPOAE检测,外毛细胞没有显著差异。耳蜗石蜡切片H＆E染色观察耳蜗的形态学改变,发现mTOR基因敲除型小鼠耳蜗形态无异常。通过基底膜铺片免疫荧光染色发现出生后45天左右mTOR基因敲除小鼠与野生型小鼠相比,毛细胞的形态和数量无显著变化,但是mTOR基因敲除小鼠突触数量有明显的降低,据分析,有统计学差异。本课题成功的建立了 mTOR条件性基因敲除小鼠模型,此模型可以作为研究mTOR在内耳听觉系统功能的理想动物模型。研究结果显示,mTOR基因敲除小鼠在出生后30天,听阈正常,但是在出生后45天小鼠听力就发生了严重的损伤,并且突触数量有显著降低。这些结果证明mTOR是通过影响突触的变化进而影响小鼠的听觉功能。

关键词： mTOR 耳聋突触听觉系统条件敲除