Ronin调控造血干细胞功能与机制研究

作     者：杨小玉 

作者单位：安徽医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李长燕

授予年度：2020年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100101[医学-人体解剖与组织胚胎学] 10[医学] 

主      题：THAP11 条件敲除 转录因子 造血干细胞 胚胎造血 

摘      要：THAP11是THAP转录因子家族的成员,广泛参与多种生物学过程。Ronin是THAP11在小鼠中的同源基因,DNA序列同源性高达83%。据报道Ronin通过与转录辅助因子结合调控基因特异性表达,进而影响胚胎干细胞干性维持、线粒体电子传递链以及细胞代谢等生理过程。Ronin全身性敲除的小鼠胚胎在E7.0天时发育停滞,在心脏特异敲除Ronin则会导致小鼠心脏发育不全并且功能障碍,视网膜细胞条件敲除小鼠视网膜发育障碍以及斑马鱼Ronin缺失后导致颅面发育畸形等,表明Ronin对于多种器官的发育至关重要。但Ronin在造血系统中的研究尚未有报道,我们实验前期发现THAP11调节红系与巨核系分化平衡,并且发现在人CD34细胞中敲低THAP11导致体内重建造血能力降低。在造血系统特异敲除Ronin导致小鼠胚胎期死亡,表明Ronin对小鼠胚胎造血系统发育具有重要调控作用。本研究利用Ronin条敲(Ronin conditional knockout,Ronin CKO)小鼠模型系统评估了Ronin对胚胎造血的调控作用。首先通过分析E13.5-E15.5天小鼠胚胎外周血红细胞数量、血红蛋白含量、红系发育标记物、红细胞脱核情况以及检测胎肝中红系相关基因表达等,明确Ronin对胚胎红系造血的影响。其次通过流式细胞术分析造血干/祖细胞及其他谱系的分布情况;利用集落形成实验检测Ronin CKO小鼠胎肝造血干细胞(HSC)体外功能,同时进行竞争、非竞争移植实验与救治急性放射病模型评估Ronin CKO小鼠胎肝造血干细胞体内功能;通过流式及Seahorse XF分析仪等检测Ronin CKO小鼠造血干细胞的细胞周期、凋亡、线粒体能量供应能力以及ROS情况。最后利用RNA-Seq检测Ronin CKO胎肝Linsca1c-kit(LSK)细胞中基因表达变化,并整合人CD34细胞中THAP11ChIP-seq数据,预测Ronin调控造血干细胞功能的机制。本研究结果显示,造血系统缺失Ronin可导致小鼠胎肝红细胞数量明显减少、血红蛋白含量降低、红细胞脱核比例降低以及红系相关基因表达明显下调,表明贫血是胚胎死亡的直接原因,同时发现红系发育R3期数量明显降低,表明红系发育阻滞在R3时期。进一步发现Ronin CKO小鼠胚胎中全谱系血细胞减少,LSK细胞比例和数量增多,多能祖细胞(Multipotent progenitors,MPP)数量增多,而造血祖细胞(Hematopoietic progenitor cells,HPC)以及各定向祖细胞(CMP,GMP,MEP等)均数量降低,表明Ronin调控小鼠造血干祖细胞发育。对胎肝HSC功能分析发现,Ronin缺失后小鼠胎肝HSC细胞体外集落形成能力明显降低、体内重建造血能力丧失,救治急性放射病的能力明显降低,说明Ronin CKO小鼠胚胎HSC功能严重障碍。此外,我们分析细胞周期发现,Ronin CKO小鼠胚胎LSK细胞G0/G1期比例减少,S期比例明显增多,G2/M期比例减少,表明Ronin参与调控小鼠胎肝HSC的细胞周期。Ronin CKO小鼠胎肝造血干祖细胞呼吸方式偏向糖酵解、最大呼吸能力明显降低并且备用呼吸能力为0,表明Ronin调控小鼠胎肝HSPC细胞线粒体功能,ROS检测发现Ronin缺失后胎肝LSK细胞ROS量明显增多。Ronin条敲后LSK细胞基因表达差异主要集中在细胞周期、线粒体、甲基化调控、乙酰化以及造血作用相关基因等。将小鼠LSK细胞RNA-seq数据与ChIP-seq(人CD34细胞、小鼠ES细胞等)数据整合分析发现,THAP11(Ronin)作为转录因子结合的DNA序列高度保守,高通量测序结果分析Ronin富集结合序列为-CTGGGAYKTGTAGT-(Y为G或A,K为T或A)。综上,Ronin是小鼠胚胎造血发育过程中必不可少的转录因子,可通过染色体上特异结合位点调控多种造血干细胞发育基因的表达。