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间质细胞双尾C基因条件性敲除小鼠模型建立及其表型分析

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中华整形外科杂志 2023年第9期39卷 1003-1009页

作者：尹艳爽李秀杨志岗马世泽曹焱肖苒中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院研究中心、中国医学科学院体表组织器官再造研究重点实验室北京100144 中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院病理科北京100144

目的构建间质细胞双尾C(Bicc1)基因条件性敲除小鼠模型,并对其表型进行分析。方法将CRISPR Cas9方法构建的Bicc1f/+小鼠子代与Pdgfra启动子驱动的Cre小鼠进行杂交,获得子代小鼠,饲养1~2周后提取其脚趾及鼠尾组织基因组DNA,经PCR扩增及... 详细信息

目的构建间质细胞双尾C(Bicc1)基因条件性敲除小鼠模型,并对其表型进行分析。方法将CRISPR Cas9方法构建的Bicc1f/+小鼠子代与Pdgfra启动子驱动的Cre小鼠进行杂交,获得子代小鼠,饲养1~2周后提取其脚趾及鼠尾组织基因组DNA,经PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳后,在DNA水平检测小鼠基因型;选取经鉴定后生长至3周龄的Bicc1基因条件性敲除小鼠(实验组)、野生型小鼠(对照组)各3只进行后续实验:通过腹腔注射他莫昔芬进行诱导敲除Bicc1基因,于1周后取小鼠肾脏、骨骼肌、皮肤及脂肪组织,一部分组织通过实时定量PCR(RT-qPCR)鉴定其中的Bicc1 mRNA表达水平;另一部分组织以10%多聚甲醛固定,随后进行HE染色和Masson染色,在光镜下观察分析。应用SPSS 28.0软件对数据进行分析,组间比较采用t检验,P基因条件性敲除小鼠,基因型为Bicc1^(f/f)Cre+/-,野生型小鼠基因型为Bicc1^(f/f)Cre^(-/-);RT-qPCR检测结果显示,实验组小鼠肾脏、骨骼肌、皮肤、脂肪组织中Bicc1 mRNA表达水平均显著低于对照组(P均基因条件性敲除小鼠模型,可以为研究Bicc1基因在组织器官间质细胞中的作用提供动物模型;3周龄小鼠间质细胞中敲除Bicc1后1周,其肾脏和骨骼肌发生病理性改变。

关键词：小鼠,基因敲除间质细胞双尾C基因条件性基因敲除他莫昔芬

应用Cre-loxP系统构建表皮细胞中p75神经营养因子受体基因条件性敲除小鼠模型及其鉴定

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中华烧伤杂志 2019年第10期35卷 740-745页

作者：孙睿曹永倩马嘉旭殷思源张敏宋茹江杭高岩张华宇冯璋刘健刘振兴王一兵山东大学附属省立医院烧伤与创面修复外科济南250021 山东第一医科大学第一附属医院济南250014

目的应用Cre-loxP系统构建表皮细胞中p75神经营养因子受体(p75NTR )基因条件性敲除的小鼠模型并进行鉴定。方法应用Cre-loxP系统将5只6~8周龄雌雄不限(用于繁殖的小鼠鼠龄和性别下同)p75NTRflox/flox转基因C57BL/6J小鼠和5只角蛋白14启... 详细信息

目的应用Cre-loxP系统构建表皮细胞中p75神经营养因子受体(p75NTR )基因条件性敲除的小鼠模型并进行鉴定。方法应用Cre-loxP系统将5只6~8周龄雌雄不限(用于繁殖的小鼠鼠龄和性别下同)p75NTRflox/flox转基因C57BL/6J小鼠和5只角蛋白14启动子驱动(KRT14-)Cre+/-转基因C57BL/6J小鼠进行饲养和杂交。从繁育产生的第1代小鼠中筛选出5只p75NTRflox/+·KRT14-Cre+/-小鼠与5只p75NTRflox/flox小鼠进行交配,获得第2代小鼠。第2代小鼠出生20~25d,切取每只小鼠鼠尾,通过PCR法进行基因型鉴定。分别选取经鉴定后生长至6周龄的p75NTR基因完全条件性敲除小鼠、野生型小鼠各4只处死,切取腹部皮肤组织和脑组织,经免疫组织化学染色对比观察p75NTR在2种小鼠2种组织中的表达情况;另切取腹部皮肤组织,经苏木精-伊红染色观察2种小鼠组织形态学变化。结果(1)共繁育第2代小鼠20只,其中4只小鼠基因型为p75NTRflox/flox·KRT14-Cre+/-(p75NTR-/-),即p75NTR基因完全条件性敲除小鼠;5只小鼠基因型为p75NTRflox/+·KRT14-Cre+/-,即p75NTR基因部分条件性敲除小鼠;5只小鼠基因型为p75NTRflox/flox·KRT14-Cre-/-,6只小鼠基因型为p75NTRflox/+·KRT14-Cre-/-,均为野生型小鼠。(2)p75NTR基因完全条件性敲除小鼠皮肤表皮组织中未见p75NTR表达,野生型小鼠皮肤表皮组织中可见较多p75NTR阳性表达;p75NTR基因完全条件性敲除小鼠和野生型小鼠脑组织中均有丰富p75NTR阳性表达。(3)p75NTR基因完全条件性敲除小鼠和野生型小鼠皮肤表皮组织均无生长异常情况且毛囊结构均完整。结论应用Cre-loxP系统能够成功构建表皮细胞中p75NTR基因条件性敲除小鼠模型且小鼠皮肤组织形态无明显变化。

关键词：受体,神经生长因子类角蛋白14 模型,动物条件性基因敲除表皮细胞 Cre-loxP系统

条件性基因敲除:骨髓细胞特异性敲除Ncol2基因小鼠的建立和基因型鉴定

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四川动物 2011年第6期30卷 961-963页

作者：郝海邦杨承忠岳碧松四川省濒危野生动物保护生物学重点实验室四川大学生命科学院成都610064

Ncol2是新发现的参与免疫调节的重要因子,Ncol2基因骨髓细胞特异性敲除小鼠的建立,能够有针对性的研究Ncol2基因缺失后对免疫系统的影响。根据条件性基因敲除的原理,本文利用loxp转基因小鼠和在骨髓细胞特异性表达Cre重组酶的LysMcre小... 详细信息

Ncol2是新发现的参与免疫调节的重要因子,Ncol2基因骨髓细胞特异性敲除小鼠的建立,能够有针对性的研究Ncol2基因缺失后对免疫系统的影响。根据条件性基因敲除的原理,本文利用loxp转基因小鼠和在骨髓细胞特异性表达Cre重组酶的LysMcre小鼠,繁殖建立了骨髓细胞特异性敲除Ncol2基因的小鼠,并提供了用鼠尾做基因型鉴定的简便方法。

关键词：条件性基因敲除骨髓细胞 Ncol2基因基因型鉴定

γ-氨基丁酸能神经元条件性敲PGC-1α基因小鼠的制备

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中华医学遗传学杂志 2017年第2期34卷 200-204页

作者：王佳常宪鲁钱进军姜扬王春艳王玉聪冯驰王永洁夏培慧张颖吴丹萍张维宁江苏大学医学院江苏镇江212013 江苏大学第四附属人民医院神经内科江苏镇江202001 江苏大学第五附属人民医院精神科江苏镇江212000

目的制备在γ-氨基丁酸能神经元条件性敲除过氧化物酶体增殖物激活受体了辅激活因子-1α（peroxisomprolKerator—activate dreceptor-γ coactivator-1，PGC-1γ）基因小鼠。方法从美国Jackson Lab引进SPF级条件性敲除PGC-1α基因的杂... 详细信息

目的制备在γ-氨基丁酸能神经元条件性敲除过氧化物酶体增殖物激活受体了辅激活因子-1α（peroxisomprolKerator—activate dreceptor-γ coactivator-1，PGC-1γ）基因小鼠。方法从美国Jackson Lab引进SPF级条件性敲除PGC-1α基因的杂合子小鼠PGC—1α^t/＋，通过饲养、繁育获得PGC-1α^t/＋纯合子小鼠。通过将PGC-1α^t/＋小鼠与在γ～氨基丁酸能神经元表达Cre重组酶的Dlx5／6-Cre—IRES-EGFP小鼠进行繁育，获得在γ-氨基丁酸能神经元条件性敲除PGC-1α的基因鼠PGC-1α^t/tDfl5/6-Cre-IRES-EGFP。结果成功制备了在γ-氨基丁酸能神经元条件性敲除PGD1α的基因鼠。结论成功引进PGC-1α^t/＋杂合子小鼠，应用合理的基因敲除策略，获得在γ-氨基丁酸能神经元敲除PGC—1α的基因鼠，为神经精神疾病的机制研究提供了一种可信的模型动物。

关键词：过氧化物酶体增殖物激活受体7辅激活因子-1α 条件性基因敲除小鼠中间神经元

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条件性敲除Med23基因对成年小鼠海马新生神经元及行为的影响

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神经解剖学杂志 2021年第3期37卷 293-298页

作者：孙颖志陈国艳空军军医大学唐都医院放射科西安710038 空军军医大学唐都医院神经内科西安710038

目的:观察条件性敲除中介体亚单位23(Med23)基因对小鼠海马神经发育和行为的影响。方法:利用灌胃方法给予Med23 CKO小鼠他莫昔芬(TAM),通过括旷场实验、悬尾实验和黑白箱实验检测检测小鼠的行为,利用免疫荧光染色检测小鼠海马5-溴-2-脱... 详细信息

目的:观察条件性敲除中介体亚单位23(Med23)基因对小鼠海马神经发育和行为的影响。方法:利用灌胃方法给予Med23 CKO小鼠他莫昔芬(TAM),通过括旷场实验、悬尾实验和黑白箱实验检测检测小鼠的行为,利用免疫荧光染色检测小鼠海马5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)、mKi-67基因编码核蛋白(Ki67)、微小染色体维持蛋白2(MCM2)、双皮质素(DCX)和神经源性分化因子(NeuroD)的表达。结果:与WT小鼠相比,Med23 CKO小鼠中间静息时间明显缩短(P性细胞数也明显减少。结论:Med23参与调节小鼠海马神经化生,海马Med23缺失会导致小鼠出现焦虑及抑郁行为。

关键词：条件性基因敲除中介体复合物23亚单位焦虑抑郁小鼠

Tex101条件性基因敲除小鼠模型的建立和表型鉴定

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上海交通大学学报（医学版） 2014年第1期34卷 1-6页

作者：冯贵莲舒洋王保曼朱于非胡兰靛上海交通大学医学院/中科院上海生命科学研究院健康科学研究所分子遗传学研究组上海200025

目的建立Tex101(Testis expressed gene 101)条件性基因敲除小鼠模型并进行表型鉴定。方法构建针对小鼠Tex101基因2、3号外显子的重组载体,通过电穿孔的方法转染胚胎干细胞(ES细胞),用正负筛选法筛选阳性ES细胞并进行PCR鉴定。利用显微... 详细信息

目的建立Tex101(Testis expressed gene 101)条件性基因敲除小鼠模型并进行表型鉴定。方法构建针对小鼠Tex101基因2、3号外显子的重组载体,通过电穿孔的方法转染胚胎干细胞(ES细胞),用正负筛选法筛选阳性ES细胞并进行PCR鉴定。利用显微注射把发生正确同源重组的ES细胞注射进C57BL/6J小鼠囊胚,移入受体小鼠子宫。将得到的嵌合体小鼠与C57BL/6J雌鼠交配获得Tex101-LoxP转基因小鼠。该小鼠与EⅡa-Cre转基因小鼠杂交,通过子代自交获得Tex101条件性基因敲除(cKO)小鼠并进行初步分析。结果得到2只Tex101 cKO雄鼠。冰冻切片观察发现Tex101 cKO雄鼠睾丸形态和大小与野生型小鼠相比无明显差异。结论成功建立了Tex101条件性基因敲除小鼠模型,并初步验证了该基因对雄性小鼠睾丸大小和形态无明显影响,为进一步研究Tex101基因功能奠定了基础。

关键词： Tex101 条件性基因敲除胚胎干细胞 EⅡa-Cre转基因小鼠

成骨细胞条件性FoxO1基因敲除糖尿病小鼠模型的建立

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国际口腔医学杂志 2018年第2期45卷 170-176页

作者：熊毅宫苹伍颖颖口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院种植科成都610041

目的建立成骨细胞条件性FoxO1基因敲除的糖尿病小鼠模型,并进行初步的表型研究。方法设计基因敲除策略,获得野生型和纯合小鼠。提取鼠尾组织DNA,经聚合酶链式反应(PCR)扩增后鉴定其基因型。分别提取小鼠原代成骨细胞mRNA和蛋白质,以及... 详细信息

目的建立成骨细胞条件性FoxO1基因敲除的糖尿病小鼠模型,并进行初步的表型研究。方法设计基因敲除策略,获得野生型和纯合小鼠。提取鼠尾组织DNA,经聚合酶链式反应(PCR)扩增后鉴定其基因型。分别提取小鼠原代成骨细胞mRNA和蛋白质,以及其他组织的mRNA,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot技术检验FoxO1的表达。在不同时间点监测小鼠体重、血糖,并进行胰岛素耐受实验。结果成功建立FoxO1基因敲除小鼠模型并诱发糖尿病,糖尿病小鼠从第2周开始体重明显低于正常小鼠。在糖尿病条件下,纯合小鼠血糖值明显低于野生型小鼠,其胰岛素敏感性明显高于野生型小鼠。结论成功建立了成骨细胞条件性FoxO1基因敲除小鼠模型;FoxO1基因敲除可改善糖尿病小鼠的高糖血症,可能是由于FoxO1基因敲除增加了糖尿病小鼠的胰岛素敏感性。

关键词：叉头转录因子条件性基因敲除糖尿病

条件性Smad4基因敲除鼠模型的建立和鉴定及初步表型

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国际眼科杂志 2014年第1期14卷 17-22页

作者：刘瑛林丁长沙爱尔眼科医院中国湖南省长沙市410015

目的:利用Cre/LoxP系统建立眼组织特异性Smad4基因敲除小鼠并进行初步表型分析。方法:通过PAX6启动子驱动的Cre转基因小鼠(Le-Cre)作为介导敲除的工具鼠,将其与Smad4条件基因小鼠(Smad4fl/fl)结合获得Le-Cre特异性Smad4基因敲除小鼠或... 详细信息

目的:利用Cre/LoxP系统建立眼组织特异性Smad4基因敲除小鼠并进行初步表型分析。方法:通过PAX6启动子驱动的Cre转基因小鼠(Le-Cre)作为介导敲除的工具鼠,将其与Smad4条件基因小鼠(Smad4fl/fl)结合获得Le-Cre特异性Smad4基因敲除小鼠或变异小鼠(Le-Cre;Smad4fl/fl)。为了证实条件性基因敲除的特异性及有效性,通过PCR技术对小鼠或鼠胚进行了相关基因分析,特定组织绿色荧光蛋白(GFP)的表达及Smad4蛋白的检测,同时利用ROSA26报导基因小鼠藉LacZ染色显示Le-Cre在眼组织的表达;并对Smad4变异小鼠的表型进行了观察。结果:早在E10.0左右,鼠胚晶状体位置及眼周外胚层发现强荧光的GFP表达,表明Le-Cre明确出现在特定的靶组织。通过小鼠基因型分析,确定了小鼠或鼠胚是否携带Cre重组酶基因、Smad4条件性等位基因和/或Rosa报导基因,对小鼠晶体DNA的基因分析也证实Smad4基因在某些特异性眼组织内得到剔除。通过在Cre转基因小鼠导入报导基因,并籍LacZ染色对Cre重组酶的表达进行检测,显示了Cre重组酶的时空表达及其表达的组织特异性。Smad4免疫组化染色显示,在正常发育胚鼠眼可见广泛的Smad4表达,早期主要存在于胞浆,随着胚眼发育向核内转移;而在Smad4变异鼠胚眼,结果表明Smad4在Cre重组酶所表达的组织内缺乏表达。观察发现Smad4变异鼠可以顺利存活,但表现出眼球缩小、眼窝凹陷、眼睑畸形开放、闭合不能及眼周毛发脱失的外观。结论:通过基因和蛋白水平的检测证实了Le-Cre;Smad4基因敲除鼠的建立及Smad4在变异小鼠中表达的缺乏。Smad4在眼组织的敲除导致了眼及附属器的明显异常,为深入了解眼球发育及Smad4对其影响的机制提供了一个可信的动物模型。

关键词： Smad4 条件性基因敲除 Le—Cre 报告基因眼表型

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GPR126条件性基因敲除载体的快速构建

中国生物工程杂志 2013年第4期33卷 106-113页

作者：叶湘漓李大力湖南师范大学医学院长沙410013 华东师范大学生命科学学院生命医学研究所上海200241

基因敲除小鼠模型是在动物体内研究基因功能的重要和可靠的手段之一,而构建用于同源重组的基因敲除载体是构建基因敲除小鼠模型的关键一步。条件性基因敲除技术将针对靶基因的修饰作用限制在小鼠的特定发育时期或特定类型的组织细胞中,... 详细信息

基因敲除小鼠模型是在动物体内研究基因功能的重要和可靠的手段之一,而构建用于同源重组的基因敲除载体是构建基因敲除小鼠模型的关键一步。条件性基因敲除技术将针对靶基因的修饰作用限制在小鼠的特定发育时期或特定类型的组织细胞中,通过加入具有位点特异性的重组系统,该修饰作用在时间和空间上均处于可调控的状态;条件性基因敲除技术既可以避免某些具有重要功能基因的敲除所带来的早期胚胎致死问题,还可用于精确分析某些多效基因在不同组织或不同发育阶段的特定功能差异。通过合理利用改良的Red重组系统,将两个LoxP位点快速准确地插入到了目标位置,实现了GPR126条件性基因敲除载体的快速构建,为后续的构建GPR126基因敲除小鼠模型、在动物体内研究基因的功能奠定了基础。

关键词：条件性基因敲除打靶载体 Red 重组酶