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作者：司洪阳沈阳农业大学

学位级别：硕士

放线菌是一类重要的微生物资源,能产生丰富具有活性的次级代谢产物,这些物质在植物病害生物防治方面具有广泛的应用。本实验室通过前期筛选,获得了一株具有自主知识产权的杀真菌链霉菌(Streptomyces fungicidicus),其发酵液对植物病原... 详细信息

放线菌是一类重要的微生物资源,能产生丰富具有活性的次级代谢产物,这些物质在植物病害生物防治方面具有广泛的应用。本实验室通过前期筛选,获得了一株具有自主知识产权的杀真菌链霉菌(Streptomyces fungicidicus),其发酵液对植物病原真菌具有很好的防治效果,本文围绕发酵液中抑菌活性物质的分离纯化及结构解析展开深入研究,获得以下结果:该链霉菌经液体培养基发酵培养后,通过离心、滤膜过滤去除菌丝体和培养基组分,收集发酵液,用XAD-16大孔树脂对发酵液中活性物质进行吸附,然后用50%甲醇浸泡树脂,经二氯甲烷萃取,收集二氯甲烷相,浓缩后获得3.1 g粗提物浸膏。对粗提物进行一级硅胶柱层析,共获得15个不同组分,编号为15。以烟草赤星病菌(Alternaria alternata)为指示菌,采用杯碟法对这15个组分进行活性测定,其中有6个组分有活性,用十字交叉法分别测量抑菌圈直径大小,3号和6号组分的抑菌圈直径最大,分别为37.2 mm和30.8 mm。3号组分经二级硅胶柱层析,Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析,获得一个化合物A3,并通过薄层层析检测,该物质在硅胶板上成单一的色谱点,通过分析型高效液相进行分析,在第19 min时出现了一个单一的峰,判断该物质为单体化合物。6号组分经过制备型高效液相色谱反复制备分离,共获得了4个单体化合物,F1、F2、F3和F8。采用核磁共振、质谱等多种结构鉴定方法对上述五个单体化合物进行结构鉴定。结合谱图检测数据和相关文献数据,确定这5个化合物中,A3、F1、F2和F3为已知化合物,分别是:邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl Phthalate)、环(苯丙氨酸-脯氨酸)二肽(Cyclo-(Phe-Pro))、环(脯氨酸-亮氨酸)二肽(Cyclo-(Pro-Leu))、环(脯氨酸-异亮氨酸)二肽(Cyclo-(Pro-Ile));通过SCI Finder数据库查找,发现没有与F8结构一致的化合物,因此将化合物F8鉴定为新的天然产物,将其命名为6-(5-hydroxy-6-methylheptyl)-5,6-dihydro-2H-pyran-2-one。采用96孔板微量稀释法对5个化合物抗植物病原真菌活性进行研究,结果表明,5个化合物均有抗烟草赤星病菌活性,且化合物A3和F8的抑菌活性较好,其IC分别为22.9μg/mL和20.8μg/mL。此外,这也是该类化合物在防治烟草赤星病害上的首次报道。通过单因子试验明确了链霉菌发酵培养基中最适碳源和氮源,分别是淀粉和花生饼粉。利用Plackett-Burman试验筛选出培养基中对活性物质产生影响较大的成分,分别是淀粉和硫酸铵;同时利用响应面法,选取淀粉、花生饼粉和硫酸铵这三个因素进行Box-Behnken实验设计,通过多元回归分析,得到三种成分优化后的浓度分别为,淀粉27.15 g/L,花生饼粉27.88 g/L,硫酸铵0.72 g/L,优化后的发酵液抑菌圈直径的平均值为33.05 mm,较优化之前提高了31.2%。利用简并引物,对链霉菌进行Ⅰ型聚酮合酶(PKS-Ⅰ)、Ⅱ型聚酮合酶(PKS-Ⅱ)和非核糖体肽合成酶(NRPS)功能基因的扩增,评估其可能产生的次级代谢产物的类别,结果表明,该菌株分别含有PKS-Ⅰ和NRPS相关基因,具有催化产生聚酮类化合物和非核糖体肽类物质的潜力。

关键词：杀真菌链霉菌次级代谢产物分离纯化结构鉴定功能基因

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反向筛选标记基因upp在杀真菌链霉菌遗传改造中的应用

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中国生物工程杂志 2019年第11期39卷 78-86页

作者：吴果果宋淑婷岳荣张晶关莹王玥刘宝爱吕学敏魏建军张会图天津科技大学生物工程学院天津300457 天津市新星兽药厂天津300402

为进一步简化放线菌的遗传操作流程,缩短重组菌株的筛选周期,在对杀真菌链霉菌(Streptomyces fungicidicus ATCC 21013)进行遗传操作的过程中引入了一个反向筛选标记基因——尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(upp)。并通过原始菌株中upp基因的... 详细信息

为进一步简化放线菌的遗传操作流程,缩短重组菌株的筛选周期,在对杀真菌链霉菌(Streptomyces fungicidicus ATCC 21013)进行遗传操作的过程中引入了一个反向筛选标记基因——尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(upp)。并通过原始菌株中upp基因的敲除,以及带有upp基因的自杀型基因敲除载体的构建,开发了一套完整的针对杀真菌链霉菌的无痕敲除系统。通过载体的整合、二次交换及反向筛选实现了杀真菌链霉菌基因组中StrR基因的快速无痕敲除。upp反向筛选标记基因的引入使得链霉菌重组菌株的平均筛选周期缩短了2周左右,并进一步减少了假阳性重组菌株出现的概率,可实现放线菌中目的基因的连续无痕敲除,因此值得进一步推广和应用。

关键词：杀真菌链霉菌反向筛选标记尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因敲除

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小基因组技术在恩拉霉素生产菌种改造中的应用

小基因组技术在恩拉霉素生产菌种改造中的应用

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作者：吴果果天津科技大学

学位级别：硕士

恩拉霉素是从土壤微生物杀真菌链霉菌(Streptomyces fungicidicus)中分离获得的一种非核糖体多肽类抗生素,对动物消化系统致病菌荚膜梭状杆菌、链球菌等具有良好的杀灭及抑制作用,且相比其他抗生素有较好的稳定性、残留低、不易产生耐... 详细信息

恩拉霉素是从土壤微生物杀真菌链霉菌(Streptomyces fungicidicus)中分离获得的一种非核糖体多肽类抗生素,对动物消化系统致病菌荚膜梭状杆菌、链球菌等具有良好的杀灭及抑制作用,且相比其他抗生素有较好的稳定性、残留低、不易产生耐药性等优势,而被广泛应用于家禽养殖业添加到动物的饲料中来促进动物的生长速度。为进一步简化放线菌的遗传操作流程,缩短重组菌株的筛选周期,在对杀真菌链霉菌进行遗传操作的过程中引入了一个反向筛选标记基因——尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(upp)。并通过原始菌株中upp基因的敲除,以及带有upp基因的自杀型基因敲除载体的构建,开发了一套完整的针对Streptomyces fungicidicus的敲除系统。upp反向筛选标记基因的引入使得链霉菌重组菌株的平均筛选周期缩短了 2周左右,并进一步减少了假阳性重组菌株出现的概率,可实现放线菌中目的基因的连续无痕敲除。本研究是在完成杀真菌链霉菌全基因组测序的基础上利用小基因组技术对其基因组进行了优化和精简。全基因组测序结果表明,基因组由6740768bp的染色体组成。通对全基因组数据进行生物信息学分析发现:Streptomyces fungicidicus基因组有6991个基因,线性质粒925644 bp,除与恩拉霉素生物合成相关基因簇外,基因组当中还有四个大片段非核糖体多肽合成酶基因(NRPS)以及三个基因簇较大的聚酮合酶基因(PKS),这7个基因簇总长162788bp约占全基因组的2.41%左右。为了对其基因组进行精简以提高恩拉霉素产量和菌体生长速度,本研究采取了温度敏感型质粒结合tsr、upp正反向筛选标记相结合的策略首先对通过基因组数据挖掘分析发现的7个次级代谢基因簇分别进行了单敲除。其中nrps1和nrps4不能被敲除可能与细胞壁的合成相关,nrps2和nrps3基因敲除后,摇瓶发酵条件下菌株产素水平分别提高了 42.8和40.6%。而聚酮类化合物基因敲除后除pks3外基因簇的删除均对菌丝体生长、孢子形成以及恩拉霉素产量产生了非常明显的影响。其中pks1基因敲除后菌株生长速度及产素水平大幅度下降,pks2基因敲除后的孢子颜色从原始的灰色变成了灰白色。然后本研究将产素能力高的nrps2、nrps3阻断菌株进行了连续无痕敲除,双阻断菌株产素水平提高幅度没有超过单独敲除的菌株,说明杀真菌链霉菌产恩拉霉素受到了复杂的调控,不是同一类的次生代谢流之间存在相互影响,形成了复杂的网络关系,产素水平不能用简单的加减法而进累积计算。

关键词：恩拉霉素杀真菌链霉菌尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因敲除非核糖体多肽

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恩拉霉素高产菌株选育的研究

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中国抗生素杂志 2018年第11期43卷 1384-1388页

作者：丁亚莲李春玲牛春张萍宁夏泰瑞制药股份有限公司银川750101

目的进一步提高恩拉霉素发酵生产水平。方法对杀真菌链霉菌RN16-7进行ARTP(常压室温等离子体)等离子与庆大霉素复合处理。结果经大量筛选,得到了恩拉霉素高产突变株RN16-242,其遗传性状稳定,发酵效价达7423u/mL,比出发菌株RN16-7(4703u/... 详细信息

目的进一步提高恩拉霉素发酵生产水平。方法对杀真菌链霉菌RN16-7进行ARTP(常压室温等离子体)等离子与庆大霉素复合处理。结果经大量筛选,得到了恩拉霉素高产突变株RN16-242,其遗传性状稳定,发酵效价达7423u/mL,比出发菌株RN16-7(4703u/mL)提高了57.8%。菌株保存,采用甘油管低温保藏法、沙土管保藏法和冷冻真空干燥保藏法进行了比较,结果是甘油管低温保藏法最好。

关键词：恩拉霉素杀真菌链霉菌菌种选育抗生素

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农用抗生素TS99产生菌YH9407的初步研究

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沈阳农业大学学报 2004年第2期35卷 93-96页

作者：文才艺吴元华祁岑王春梅丁彦丽沈阳农业大学植物保护学院辽宁沈阳110161

从辽宁省丹东地区的土壤样品中分离到一株新的杀真菌链霉菌YH9407,其产生的次级代谢产物对多种植物病原真菌和细菌有较强的抑制作用。该菌株在各种合成培养基上生长良好 ,气生菌丝和孢子堆为灰白色 ,基内菌丝一般为浅黄色 ,有的可产生... 详细信息

从辽宁省丹东地区的土壤样品中分离到一株新的杀真菌链霉菌YH9407,其产生的次级代谢产物对多种植物病原真菌和细菌有较强的抑制作用。该菌株在各种合成培养基上生长良好 ,气生菌丝和孢子堆为灰白色 ,基内菌丝一般为浅黄色 ,有的可产生黄色可溶性色素 ;孢子丝柔曲或直立 ,直径为0.17～0.22μm,孢子呈球形或卵圆形 ,直径为(0.6～0.8)μm×(0.8～1.2)μm ;通过与杀真菌链霉菌已知种在形态特征、培养特征和生理生化特性方面的比较 ,YH9407为杀真菌链霉菌的一个新菌株 ,暂命名为StreptomycesfungicidicusNo.

关键词：杀真菌链霉菌 YH9407 次级代谢产物农用抗生素 TS99 鉴定

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农用抗生素TS99产生菌YH9407的初步研究

农用抗生素TS99产生菌YH9407的初步研究

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第二届全国绿色环保农药新技术、新产品交流会

作者：文才艺吴元华祁岑王春梅丁彦丽沈阳农业大学植物保护学院沈阳农业大学植物保护学院沈阳农业大学植物保护学院沈阳农业大学植物保护学院沈阳农业大学植物保护学院

从辽宁省丹东地区的土壤样品中分离到一株新的杀真菌链霉菌YH9407,其产生的次级代谢产物对多种植物病原真菌和细菌有较强的抑制作用。该菌株在各种合成培养基上生长良好,气生菌丝和孢子堆为灰白色,基内菌丝一般为浅黄色,有的可产生黄色... 详细信息

从辽宁省丹东地区的土壤样品中分离到一株新的杀真菌链霉菌YH9407,其产生的次级代谢产物对多种植物病原真菌和细菌有较强的抑制作用。该菌株在各种合成培养基上生长良好,气生菌丝和孢子堆为灰白色,基内菌丝一般为浅黄色,有的可产生黄色可溶性色素:孢子丝柔曲或直立,直径为0,17～0,22μm,孢子呈球形或卵圆形,直径为(0.6～0.8)μm×(0.8～1.2)μm;通过与杀真菌链霉菌已知种在形态特征、培养特征和生理生化特性方面的比较,YH9407为杀真菌链霉菌的一个新菌株,暂命名为Streptomyces fungicidicus No.9407。

关键词：链霉菌杀真菌链霉菌 YH9407 鉴定

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