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朊蛋白影响U937抑瘤效果关键通路研究

朊蛋白影响U937抑瘤效果关键通路研究

作者：黄小珍华东师范大学

学位级别：硕士

朊蛋白（Prion protein,PrP）是由Prnp基因编码,在细胞膜表面广泛表达的糖蛋白。以往大量研究关注其在神经系统中的生理功能和致病机理,而本课题组前期体外实验发现PrP敲降可增强免疫细胞系抗肿瘤效果。本研究从体内、体外两方面检测Pr... 详细信息

朊蛋白（Prion protein,PrP）是由Prnp基因编码,在细胞膜表面广泛表达的糖蛋白。以往大量研究关注其在神经系统中的生理功能和致病机理,而本课题组前期体外实验发现PrP敲降可增强免疫细胞系抗肿瘤效果。本研究从体内、体外两方面检测PrP敲降的人组织淋巴瘤细胞系U937对肿瘤细胞的抑制作用,并探究PrP影响免疫细胞系抗肿瘤效果的关键通路。体外实验中用小鼠黑色素瘤细胞系B16、小鼠Lewis肺癌细胞系LLC1分别与U937-siLuc（PrP正常表达）、U937-siPrP（PrP低表达）细胞共培养以模拟肿瘤微环境,采用MTT法和CCK8法分别测定肿瘤细胞和U937细胞的增殖速率;取共培养后的U937-siLuc和U937-siPrP细胞进行转录组测序并进行基因表达差异比较、差异基因GO通路富集分析以及GSEA通路富集分析等。体内实验则采用肿瘤细胞分别与不同U937细胞进行尾静脉共注射,检测各组的肿瘤数目和存活时间,进一步验证PrP低表达的U937细胞的体内抑瘤作用。研究结果表明,体外培养过程中,相比U937-siLuc细胞,U937-siPrP细胞抑瘤效果更明显且各组均具有显著性差异（P＜0.05）,说明PrP的低表达增强了U937细胞的免疫活性。而转录组测序显示在与肿瘤细胞共培养后,相比U937-siLuc细胞,U937-siPrP细胞免疫相关的通路显著正向富集,涉及白细胞增殖分化、炎症反应、细胞因子产生及活化等,说明肿瘤细胞能刺激U937-siPrP细胞产生更强的免疫活性。在体内实验中,肿瘤细胞和U937-siPrP细胞共注射组存活时间较长,存活率较高,肺肿瘤数目较少,说明U937-siPrP细胞具有更强的体内抑瘤效果。综上所述,PrP低表达的U937细胞与肿瘤细胞共培养时具备较高的免疫活性,在体外体内都具有较强的抗肿瘤效果。而U937-siPrP作为基因改造后的人源免疫细胞系,能在小鼠体内起抑制肿瘤作用,也为将来的肿瘤免疫治疗提供了创新思路。

关键词： U937细胞系朊蛋白免疫治疗黑色素瘤 Lewis肺癌

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朊蛋白影响肿瘤肺转移的关键通路研究

朊蛋白影响肿瘤肺转移的关键通路研究

作者：王咪华东师范大学

学位级别：硕士

朊蛋白(Prion protein,Pr P)是一种在多种细胞表面普遍表达的糖蛋白,多个临床及体外细胞实验提示它的异常表达与肿瘤的发生发展密切相关,但既往鲜有研究使用敲除动物来探究Pr P参与肿瘤肺转移的机制。课题组前期工作已证实:在B16黑色素... 详细信息

朊蛋白(Prion protein,Pr P)是一种在多种细胞表面普遍表达的糖蛋白,多个临床及体外细胞实验提示它的异常表达与肿瘤的发生发展密切相关,但既往鲜有研究使用敲除动物来探究Pr P参与肿瘤肺转移的机制。课题组前期工作已证实:在B16黑色素瘤肺转移体内实验中,Pr P敲除小鼠更易生成肺转移灶。本课题将构建Lewis肺癌(Lewis lung carcinoma line 1,LLC1)肺转移动物模型,并在两种尾静脉注射动物模型的基础上进行血管通透性及治疗实验,以此来探究Pr P影响肿瘤肺转移的关键通路。首先在C57WT(野生型,不做任何基因修饰)、Pr P KO(朊蛋白敲除型)、△OR(朊蛋白八肽重复区(Octapeptide repeats,OR)敲除型)三种基因型小鼠上构建LLC1肺转移肿瘤模型,观察Pr P全敲或片段敲除是否会在体内促进LLC1肿瘤细胞肺转移。其次,构建小鼠B16黑色素瘤肺转移模型,取其肺部组织进行转录组测序,在转录组数据中筛选出血管相关基因,并通过实时定量PCR观察它们在不同小鼠肺组织中的表达情况。之后,选取VE钙粘蛋白(Cadherin 5,CDH5)进行免疫荧光实验以探究三种基因型小鼠的肺部血管是否存在差异。最后,利用多肽试剂OR对小鼠B16及LLC1肺转移肿瘤进行治疗。实验结果显示,在LLC1尾静脉注射肺转移肿瘤模型中,Pr P KO组小鼠以及△OR组小鼠的生存时间明显低于C57WT组小鼠,且肺部成瘤数均值均显著高于C57WT组小鼠,提示Pr P缺失可能会加速肺转移瘤的形成。肺组织转录组数据及CDH5免疫荧光结果显示,相比于C57WT组小鼠,△OR与Pr P KO组小鼠的肺血管内皮连接变弱,这可能导致肿瘤细胞更容易穿透肺部血管从而发生转移。使用多肽试剂OR对小鼠进行治疗时也发现了明显的效果:注射OR后的治疗组小鼠相比于对照组显示出生存时间的延长及肿瘤数的减少。综上所述,朊蛋白敲除可能降低了小鼠肺血管内皮连接的完整性,从而导致肿瘤细胞更容易穿透血管而发生转移;另外,朊蛋白上的OR区可能参与形成血管屏障。

关键词：朊蛋白肺转移 Lewis肺癌黑色素瘤血管内皮连接

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朊蛋白缺失对硬皮病的影响及作用机制

朊蛋白缺失对硬皮病的影响及作用机制

作者：李英华东师范大学

学位级别：硕士

朊蛋白因其能够发生构象转变导致朊病毒病而得到广泛研究。目前对朊蛋白构象和其在神经系统中的作用的研究比比皆是,但对它的基本生理功能研究甚少。PrP在多种免疫细胞中的表达让它在免疫系统中的作用不容忽视,但迄今鲜有这一方面的研... 详细信息

朊蛋白因其能够发生构象转变导致朊病毒病而得到广泛研究。目前对朊蛋白构象和其在神经系统中的作用的研究比比皆是,但对它的基本生理功能研究甚少。PrP在多种免疫细胞中的表达让它在免疫系统中的作用不容忽视,但迄今鲜有这一方面的研究。硬皮病的病理特征是皮肤增厚并纤维化,属于自身免疫病,其病因复杂。但作为自身免疫病,免疫功能失调可能是主要原因。本课题通过在正常小鼠和PrP敲除鼠上构建硬皮病模型,比较小鼠基因型之间的差异,以此来理解PrP对硬皮病的作用,从而认识PrP在免疫系统中的作用。在C57/BL/S129杂合背景的WT(野生型)、PrP(朊蛋白敲除型)、Tga20(朊蛋白高表达型)和C57B/L背景的C57BL6(野生型)、KO(朊蛋白敲除型)、△OR(朊蛋白N端八肽重复区敲除型)小鼠背部皮肤皮下注射博来霉素,构建动物硬皮病模型。对小鼠皮肤和肺的石蜡切片进行HE染色,Masson染色和天狼星红染色,并比较皮肤厚度。通过QPCR比较胶原因子表达情况。利用免疫组化和QPCR定性定量检测小鼠皮肤和肺的巨噬细胞表达情况。实验结果表明,和野生型(WT和C57 WT)小鼠相比,PrP完全缺失的小鼠(PrP和KO)硬皮病症状减轻,表现为皮肤较薄,皮肤和肺的胶原因子低表达,说明PrP的存在会促进硬皮病的发展。而△OR鼠和野生型结果一致,提示我们敲除八肽重复区并不能影响硬皮病。模型小鼠和正常小鼠相比,有更多的巨噬细胞浸润,表示巨噬细胞参与硬皮病进程。相较于WT和Tga20小鼠来说,M1巨噬细胞在PrP小鼠皮肤中高表达,M2巨噬细胞在肺中低表达,提示不同的组织器官中主导硬皮病进程的巨噬细胞不同,这有助于理解硬皮病的病因。综上所述,全长PrP敲除能减轻实验性硬皮病,只敲除八肽重复区无此作用,PrP敲除鼠皮肤M1巨噬细胞表达较高,而肺M2巨噬细胞表达偏低。因而可能在不同受累器官中巨噬细胞有不同的极化方向,影响到硬皮病进程。

关键词：朊蛋白硬皮病巨噬细胞免疫

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喉鳞状细胞癌组织中朊蛋白分子特征的分析

疾病监测 2022年第2期37卷 176-179页

作者：魏炜武月章陈冬冬宋韫韬徐国辉石琦北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所头颈外科恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室北京100142 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室北京102206

目的观察喉鳞状细胞癌组织中朊蛋白的分子特征。方法采用免疫印迹法检测朊蛋白的带型特征,采用免疫组织化学法检测朊蛋白在组织细胞中的分布特征,采用基因测序分析的方法检测分析朊蛋白基因特征。结果免疫印迹的方法显示,喉鳞状细胞... 详细信息

目的观察喉鳞状细胞癌组织中朊蛋白的分子特征。方法采用免疫印迹法检测朊蛋白的带型特征,采用免疫组织化学法检测朊蛋白在组织细胞中的分布特征,采用基因测序分析的方法检测分析朊蛋白基因特征。结果免疫印迹的方法显示,喉鳞状细胞癌组织中,朊蛋白呈现3种糖基化形式;免疫组织化学法显示,朊蛋白在喉鳞状细胞癌中可出现阳性表达,主要分布在细胞膜及胞浆。随着肿瘤恶性程度的增加,朊蛋白的表达呈逐渐增加的趋势;基因测序显示,纳入样本朊蛋白均无突变,朊蛋白129位密码子均为甲硫氨酸纯合子,219位均为谷氨酸纯合子。结论喉鳞状细胞癌组织中,朊蛋白特征有别于中枢神经系统,如脑组织;其表达与肿瘤的恶性程度相关,有可能成为早期分析诊断喉鳞状细胞的分子靶标。

关键词：喉鳞状细胞癌朊蛋白分子特征

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朊蛋白对多巴胺神经元的保护作用研究

朊蛋白对多巴胺神经元的保护作用研究

作者：陈颖华东师范大学

学位级别：硕士

朊蛋白(Prion protein,PrP)是一种高度保守的糖蛋白,由Prnp基因编码的254个氨基酸构成,通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)结构锚定在细胞膜表面,并在体内组织及器官中广泛表达,尤其在中枢神经系统内大量存在。朊蛋白错误折叠后形成具有致病性的... 详细信息

朊蛋白(Prion protein,PrP)是一种高度保守的糖蛋白,由Prnp基因编码的254个氨基酸构成,通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)结构锚定在细胞膜表面,并在体内组织及器官中广泛表达,尤其在中枢神经系统内大量存在。朊蛋白错误折叠后形成具有致病性的朊病毒(PrP),最终导致朊病毒疾病(Prion disease),该疾病的主要病理表现是神经退行性病变。目前对朊蛋白构象改变及其致病机理皆有深入的研究和报导,但对朊蛋白的生理功能仍知之甚少。帕金森病也是一种典型的神经退行性疾病,其主要病理特征是脑内黑质-纹状体区多巴胺神经元的大量变性丢失,导致多巴胺递质水平显著降低,机体出现运动功能障碍等症状。本实验利用MPTP/MPP构建帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的小鼠和细胞模型,分别通过在体和离体两个层次探索朊蛋白对多巴胺神经元是否具有保护作用,以及其和PD发病之间是否具有关联性,从而为治疗帕金森病提供新的思路和参考。实验主要分为三个部分:首先是朊蛋白敲除小鼠的验证。我们对构建的朊蛋白敲除小鼠运用PCR、WB技术,分别验证和确定朊蛋白的基因和蛋白质在KO小鼠中没有表达,并且证明敲除该基因对小鼠中脑区、纹状体区无细胞形态与数量的影响。其次是PD动物模型实验。我们分别在WT、KO小鼠中腹腔注射MPTP(30mg/kg),连续五天每天一次,构建PD小鼠模型。小鼠行为学的结果显示,朊蛋白敲除的小鼠对MPTP毒性作用更易感。同时,IHC、WB结果显示,WT+MPTP组小鼠中脑区合成多巴胺的酪氨酸羟化酶(TH)含量,TH阳性细胞数量及密度均高于KO+MPTP组;此外,WT+MPTP组的纹状体区TH、DAT的密度也显著高于KO+MPTP组。因此,动物实验层次揭示朊蛋白对多巴胺神经元具有保护作用。最后是探讨朊蛋白对多巴胺神经元的保护作用与其可能机理。我们运用离体培养的多巴胺能神经细胞系SH-SY5Y细胞,利用RNAi技术构建朊蛋白敲低的瞬转和稳转细胞系(Tcs and Scs),分别通过MPP诱导构建两种PD细胞模型。MTT与WB实验结果显示,瞬转和稳转的朊蛋白敲低细胞系经MPP诱导后,它们的细胞存活率和TH蛋白的表达量均低于用WT细胞构建的PD模型,并且Tcs+MPP组细胞的线粒体损伤更加严重、Bax表达上调明显、caspase-3大量释放,从而引发下游caspase家族的级联反应,细胞死亡加剧,因此我们推测朊蛋白可能是通过Bax-Bcl-2-caspase-3这条通路,减轻了MPTP/MPP对多巴胺神经元的毒性作用,从而延缓MPTP/MPP诱导帕金森病的发生,这个发现对帕金森病的诊疗提供了新的参考。

关键词：朊蛋白帕金森病多巴胺神经元 MPTP MPP+

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多酸及其衍生物抑制朊蛋白错误折叠的研究

多酸及其衍生物抑制朊蛋白错误折叠的研究

作者：徐畅北京化工大学

学位级别：硕士

朊病毒病是极具异质性的神经退行性疾病,致病原因包括异常蛋白质(Pr P)积累、金属离子引起的应激作用等。研究表明Pr P形成的纤维状聚集体不仅具有传染性,其沉积物还会破坏细胞膜,导致神经细胞凋亡。抑制朊蛋白构象的错误转变、减少纤... 详细信息

朊病毒病是极具异质性的神经退行性疾病,致病原因包括异常蛋白质(Pr P)积累、金属离子引起的应激作用等。研究表明Pr P形成的纤维状聚集体不仅具有传染性,其沉积物还会破坏细胞膜,导致神经细胞凋亡。抑制朊蛋白构象的错误转变、减少纤维化聚集体是朊病毒病的潜在疗法。然而,目前已报道的抑制剂存在作用方式单一、反应条件复杂、结合亲和力弱等问题。因此,开发新型朊蛋白纤维化抑制剂具有重要意义。针对现有抑制剂存在的问题,本论文利用多金属氧酸盐(POMs)的结构可调性及丰富的氧化还原特性,构筑了一系列多酸基朊蛋白纤维化抑制剂,实现了对朊蛋白多肽Pr P106-126(Pr P)聚集的有效抑制,揭示了多酸基朊蛋白纤维化抑制剂与Pr P的作用机制,为淀粉样肽纤维化抑制剂的设计提供了新思路。具体研究工作如下:1.采用过渡金属取代策略,构筑了一系列钒取代的Keggin型钨系和钼系多酸,实现了对Pr P聚集的有效抑制,降低了Pr P聚集体引起的神经毒性。H-NMR、MS和Zeta电位结果证实了两者间作用机制为静电、氧化(Met109位点)及氢键(His111位点)作用。DFT计算结果揭示了钒取代后,各种多酸在结构稳定性、氧化性、电子分布等方面存在显著差异,阐明了不同多酸对Pr P纤维化抑制作用的构效关系。结构更稳定的钨系多酸抑制Pr P聚集效果更佳;同一过渡金属体系,钒取代数目增加,多酸氧化性和VO八面体水平轴对称方向上桥联氧原子电子分布增强,因而其对作用位点的氧化和氢键作用显著增强,并提升与作用位点的结合能力,从而实现高效抑制Pr P聚集。2.采用共价修饰策略,构筑了Keggin型多酸基有机-无机杂化材料PW-Ni-Salen,实现了对Pr P纤维化的有效抑制,大幅降低了Pr P神经毒性。实验结果表明PW-Ni-Salen与Pr P间作用机制为静电和π-π堆积作用,揭示了席夫碱配体与多酸团簇的协同效应,提高与Pr P作用位点间的结合亲和力,从而显著提升了Pr P聚集的抑制效果。

关键词：多金属氧酸盐朊蛋白错误折叠抑制剂

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朊蛋白对细胞生长及炎症反应的影响

朊蛋白对细胞生长及炎症反应的影响

作者：张显凯华东师范大学

学位级别：硕士

朊蛋白(Prion protein,PrP)是位于细胞膜表面的糖蛋白,由PRNP基因所编码的253个氨基酸组成,在机体内多个组织和器官中广泛表达,其构象错构则会转变为具有传染性的朊病毒(PrP)。既往对朊病毒在传播途径和致病机理等方面已有了较深入的研... 详细信息

朊蛋白(Prion protein,PrP)是位于细胞膜表面的糖蛋白,由PRNP基因所编码的253个氨基酸组成,在机体内多个组织和器官中广泛表达,其构象错构则会转变为具有传染性的朊病毒(PrP)。既往对朊病毒在传播途径和致病机理等方面已有了较深入的研究,但对朊蛋白的正常生理功能则所知甚少,而在神经系统以外的功能则更不明了。本研究通过利用CRISPR-Cas9和慢病毒载体的RNAi技术对不同细胞系(人结肠癌细胞系HT29以及人淋巴瘤细胞系U937)的PrP表达量进行敲除/敲低来探究PrP对于细胞的生长和炎症反应的影响,在分子水平上研究PrP的生理功能。本实验结果显示,通过CRISPR-Cas9和慢病毒载体的RNAi技术所构建的不同细胞系的PrP表达量在WB检测时均显著低于对照组,证明我们成功构建了PrP的敲低/敲除细胞系,包括HT29-PrP系,HT29-siPrP系和U937-siPrP系。之后我们对三种细胞系进行了生长及炎症反应的研究。MTT结果显示PrP表达量的降低引起了三种细胞系生长增殖速度的变慢。考虑到U937作为淋巴瘤细胞,仍具备部分免疫细胞的特性,因而又采用肿瘤细胞-免疫细胞共培养的技术研究了U937对多个肿瘤细胞系生长(HT29,人黑色素瘤细胞系MDA-MB-435和小鼠黑色素瘤系B16)的影响。MTT结果显示在共培养过程中U937-siPrP比野生型具有更强的抑制肿瘤细胞生长的作用;CCK8结果显示U937-siPrP本身受肿瘤细胞的刺激后反而要比U937-siLuc生长更快。由此可见,PrP低表达对体外单一细胞的生长都起抑制作用,但对共培养体系的细胞生长的影响则是双向的。而后在利用LPS对三种细胞系进行的炎症诱导研究中,我们发现PrP敲除/低表达的细胞系在受LPS刺激的前中期(8 h)炎症因子的表达低于野生型,比如CCL2,但在后期(24 h)则会表达更多的炎症因子,比如IL-1β。在PrP对NF-κB活化影响的研究中,发现PrP表达量降低会影响NF-κB信号通路中P65的活化入核。因此,PrP可能通过影响NF-κB信号通路的激活而影响细胞的炎症反应。

关键词：朊蛋白 CRISPR-Cas9 RNAi 炎症 NF-κB 生长

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朊样蛋白Doppel的研究进展

中国预防兽医学报 2022年第6期44卷 676-681页

作者：王川俞海山杨宇泽魏亚琴张钊万学瑞贾晓蕊吴润甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 北京市畜牧总站北京100125 甘肃省科学院生物研究所甘肃省微生物资源开发利用重点实验室/厌氧微生物中心甘肃兰州730000

传染性海绵状脑病(Transmissible spongiform encephalopathies,TSEs)是由朊蛋白(Prion protein,PrP)引起的一种致命的神经退行性疾病,最早于18世纪中期在欧洲地区羊群中发现羊瘙痒病,目前已在人和多种哺乳动物发现了传染性海绵状脑病... 详细信息

传染性海绵状脑病(Transmissible spongiform encephalopathies,TSEs)是由朊蛋白(Prion protein,PrP)引起的一种致命的神经退行性疾病,最早于18世纪中期在欧洲地区羊群中发现羊瘙痒病,目前已在人和多种哺乳动物发现了传染性海绵状脑病。现在普遍认为当人和哺乳动物的正常细胞型朊蛋白(Cellular isoform of prion protein,PrP)发生错误折叠转变为痒病型朊蛋白(Scrapie isoform of prion protein,PrP)后导致传染性海绵状脑病的发生[1]。

关键词：传染性海绵状脑病朊蛋白痒病神经退行性疾病 Prion PrP 错误折叠

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朊蛋白在LPS诱导的结肠炎症中的作用研究

朊蛋白在LPS诱导的结肠炎症中的作用研究

作者：王庆文华东师范大学

学位级别：硕士

朊蛋白(the cellular prion protein,Pr Pc)是一种通过GPI锚定在细胞膜上的糖蛋白,在脊椎动物全身多种组织、器官中有着广泛表达。现有的研究报道显示朊蛋白可能参与机体免疫调节、信号传导、细胞粘附以及迁移等生命活动,近年来也有众... 详细信息

朊蛋白(the cellular prion protein,Pr Pc)是一种通过GPI锚定在细胞膜上的糖蛋白,在脊椎动物全身多种组织、器官中有着广泛表达。现有的研究报道显示朊蛋白可能参与机体免疫调节、信号传导、细胞粘附以及迁移等生命活动,近年来也有众多研究关注于朊蛋白在炎症中的作用,但是其具体的功能尚未得到明确解释。本课题在WT(野生型)、KO(朊蛋白敲除型)以及Tg20(朊蛋白高表达型)三种小鼠上通过腹腔注射脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导炎症,通过比较小鼠间不同的炎症反应研究朊蛋白在结肠炎中的功能作用。本研究采用两种炎症诱导方案:方案一为单一高剂量LPS(10 mg/kg)诱导,持续观察6天;方案二为小剂量多次LPS(1 mg/kg/d*6 d)重复诱导,持续观察6天。实验结果显示在两种方案中KO小鼠的腹泻症状都要比WT及Tg20小鼠严重(P朊蛋白缺失可引起更严重的LPS诱导的结肠炎症,炎症持续的时间也较长,恢复速度也较慢。而高表达朊蛋白则在结肠中可以有效降低LPS引起的炎症反应。

关键词：朊蛋白脂多糖结肠炎