朊蛋白对细胞生长及炎症反应的影响

作     者：张显凯 

作者单位：华东师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：赵宇岚

授予年度：2019年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100104[医学-病理学与病理生理学] 10[医学] 

主      题：朊蛋白 CRISPR-Cas9 RNAi 炎症 NF-κB 生长 

摘      要：朊蛋白(Prion protein,PrP)是位于细胞膜表面的糖蛋白,由PRNP基因所编码的253个氨基酸组成,在机体内多个组织和器官中广泛表达,其构象错构则会转变为具有传染性的朊病毒(PrP)。既往对朊病毒在传播途径和致病机理等方面已有了较深入的研究,但对朊蛋白的正常生理功能则所知甚少,而在神经系统以外的功能则更不明了。本研究通过利用CRISPR-Cas9和慢病毒载体的RNAi技术对不同细胞系(人结肠癌细胞系HT29以及人淋巴瘤细胞系U937)的PrP表达量进行敲除/敲低来探究PrP对于细胞的生长和炎症反应的影响,在分子水平上研究PrP的生理功能。本实验结果显示,通过CRISPR-Cas9和慢病毒载体的RNAi技术所构建的不同细胞系的PrP表达量在WB检测时均显著低于对照组,证明我们成功构建了PrP的敲低/敲除细胞系,包括HT29-PrP系,HT29-siPrP系和U937-siPrP系。之后我们对三种细胞系进行了生长及炎症反应的研究。MTT结果显示PrP表达量的降低引起了三种细胞系生长增殖速度的变慢。考虑到U937作为淋巴瘤细胞,仍具备部分免疫细胞的特性,因而又采用肿瘤细胞-免疫细胞共培养的技术研究了U937对多个肿瘤细胞系生长(HT29,人黑色素瘤细胞系MDA-MB-435和小鼠黑色素瘤系B16)的影响。MTT结果显示在共培养过程中U937-siPrP比野生型具有更强的抑制肿瘤细胞生长的作用;CCK8结果显示U937-siPrP本身受肿瘤细胞的刺激后反而要比U937-siLuc生长更快。由此可见,PrP低表达对体外单一细胞的生长都起抑制作用,但对共培养体系的细胞生长的影响则是双向的。而后在利用LPS对三种细胞系进行的炎症诱导研究中,我们发现PrP敲除/低表达的细胞系在受LPS刺激的前中期(8 h)炎症因子的表达低于野生型,比如CCL2,但在后期(24 h)则会表达更多的炎症因子,比如IL-1β。在PrP对NF-κB活化影响的研究中,发现PrP表达量降低会影响NF-κB信号通路中P65的活化入核。因此,PrP可能通过影响NF-κB信号通路的激活而影响细胞的炎症反应。