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普陀山苔草植物络合素合成酶CpPCS基因克隆及其在叶中的表达分析

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草业科学 2016年第12期33卷 2503-2510页

作者：谭家郎胡永霖王成龙杨占彪朱雪梅四川农业大学环境学院四川成都611130 四川农业大学生命科学学院四川雅安625014

以超富集植物普陀山苔草(Carex putuoshan)为材料,克隆其植物络合素合酶基因CpPCS的cDNA全长序列。同时,对其进行重金属胁迫处理,研究该基因在叶中的表达特点。结果表明,该基因cDNA序列全长1 461bp,可编码486个氨基酸;与其它植物同源基... 详细信息

以超富集植物普陀山苔草(Carex putuoshan)为材料,克隆其植物络合素合酶基因CpPCS的cDNA全长序列。同时,对其进行重金属胁迫处理,研究该基因在叶中的表达特点。结果表明,该基因cDNA序列全长1 461bp,可编码486个氨基酸;与其它植物同源基因对比显示,它们的氨基酸序列相似性在63%左右;通过构建进化树发现,普陀山苔草CpPCS与小麦(Triticum aestivum)、水稻(Oryza sativa)及芦苇(Phragmites australis)等单子叶植物亲缘关系最近;荧光定量RT-PCR分析结果显示,CpPCS基因及CePCS基因受重金属铅锌胁迫上调表达,其中在叶中的表达量显著增加(P普陀山苔草植物络合素合酶蛋白基因进行了克隆鉴定,探讨该基因的结构、进化关系及其参与普陀山苔草重金属胁迫的应答模式,为进一步培育重金属污染土壤修复的植物奠定基础。

关键词：普陀山苔草植物络合素合成酶(PCS) 基因克隆序列分析

普陀山苔草（Carex putuoshanensis sp.）和金叶苔草（Carex evergold）铅锌富集及谷胱甘肽表达研究

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普陀山苔草（Carex putuoshanensis sp.）和金叶苔草（Carex ever...

作者：马建玲四川农业大学

学位级别：硕士

本文在课题组前期试验的基础上,以铅超富集植物普陀山苔草(Carex putuoshanensis sp.)和铅富集植物金叶苔草(Carex evergold)为研究对象,按照课题组前期研究的最佳铅锌处理浓度,以空白为对照,通过铅(Pb)(600 mg/L)、锌(Zn)(125 mg/L)单... 详细信息

本文在课题组前期试验的基础上,以铅超富集植物普陀山苔草(Carex putuoshanensis sp.)和铅富集植物金叶苔草(Carex evergold)为研究对象,按照课题组前期研究的最佳铅锌处理浓度,以空白为对照,通过铅(Pb)(600 mg/L)、锌(Zn)(125 mg/L)单一和铅锌(Pb+Zn)复合(Pb 600 mg/L、Zn125 mg/L)三个胁迫,对两种苔草在幼苗期、开花期和立枯期的生长响应,Pb、Zn富集及谷胱甘肽(glutathion,GSH)含量和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS)表达进行研究,探讨两种苔草在三个生长期铅锌胁迫下的Pb、Zn富集特征和GSH的表达,进一步揭示GSH表达在两种苔草铅锌富集过程中的作用,为植物修复的应用及植物对重金属耐性机制的研究提供参考。研究结果如下:(1)Pb、Zn、Pb+Zn胁迫下,与对照相比,开花期是普陀山苔草和金叶苔草对Pb、Zn胁迫响应最敏感的时期;开花期的Pb、Zn、Pb+Zn各胁迫间,普陀山苔草Pb+Zn胁迫下Pb含量大于Pb胁迫下的Pb含量,而金叶苔草则相反。因此,一定浓度的Zn促进了普陀山苔草对Pb的吸收,而抑制了金叶苔草对Pb的吸收;普陀山苔草的Pb含量大于金叶苔草。(2)Pb、Zn、Pb+Zn胁迫促进了普陀山苔草和金叶苔草不同生长期GSH的合成,在开花期,两种苔草GSH含量最大。开花期的Pb、Zn、Pb+Zn各胁迫间,普陀山苔草在Pb+Zn复合胁迫下,地上部和地下部GSH含量分别比Pb、Zn单一胁迫增加了33.45%、24.80%和76.81%、9.78%,Pb+Zn复合胁迫对普陀山苔草GSH的合成表现为协同作用;而金叶苔草地上部和地下部GSH含量分别比Pb、Zn单一胁迫减少了40.07%、18.37%和14.79%,Pb+Zn复合胁迫对金叶苔草GSH的合成具有抑制作用。(3)普陀山苔草和金叶苔草GSH合成酶GCS基因及编码的蛋白结构分析发现,普陀山苔草GCS基因(CpGCS)和金叶苔草GCS基因(CeGCS)分别含有1314bp和1392bp个碱基组成的开放阅读框,分别编码437个和463个氨基酸,其分子量分别为50.99和53.11KDa,均属于亲水性蛋白,亚细胞定位预测Cp GCS和CeGCS基因编码的蛋白主要位于细胞核和线粒体。CpGCS基因和CeGCS基因的氨基酸序列与百日菊、水稻、玉米的相似性分别为88%,83%、87%,85%、88%,90%。该基因的氨基酸序列中包含谷氨酸-半胱氨酸连接酶和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的结构域,该结构域是两种苔草响应Pb、Zn胁迫的关键。通过对Pb、Zn、Pb+Zn胁迫下两种苔草在不同生长期植物组织中GCS基因表达分析发现,两种苔草地上部和地下部GCS均上调表达,在开花期GCS基因表达量最大;开花期的Pb、Zn、Pb+Zn各胁迫间,普陀山苔草CpGCS地上部和地下部表达量在Pb+Zn胁迫下最大。同时CpGCS表达量大于CeGCS表达量,这说明CpGCS蛋白催化合成的GSH,其结合Pb的量高于CeGCS蛋白催化合成的GSH,这也是普陀山苔草的一个特性。(4)Pb、Zn和Pb+Zn胁迫下,GSH的表达对普陀山苔草和金叶苔草Pb的吸收和转运具有显著正相关作用。

关键词：普陀山苔草金叶苔草铅锌谷胱甘肽 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS)

普陀山苔草(Carex putuoshan sp.)铅锌耐性机制初步研究

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普陀山苔草(Carex putuoshan sp.)铅锌耐性机制初步研究

作者：蓝焕杰四川农业大学

学位级别：硕士

本文以课题组前期在雅安汉源县普陀山铅锌矿区所发现的苔草属一疑似新种普陀山苔草(Carex putuoshan sp.)为研究对象,通过人工砂培控制性试验,在铅、锌单一及复合处理下,从铅锌亚细胞分布、抗氧化系统响应、螯合作用三个方面对普陀山苔... 详细信息

本文以课题组前期在雅安汉源县普陀山铅锌矿区所发现的苔草属一疑似新种普陀山苔草(Carex putuoshan sp.)为研究对象,通过人工砂培控制性试验,在铅、锌单一及复合处理下,从铅锌亚细胞分布、抗氧化系统响应、螯合作用三个方面对普陀山苔草耐受重金属机制进行了研究;利用同源克隆的方法克隆了普陀山苔草两个重金属耐性基因,金属硫蛋白Ⅱ型基因(CpMT2)和Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(CpGCS)的保守片段;利用实时荧光定量PCR技术分析了普陀山苔草在铅锌胁迫下CpMT2和CpGCS的表达量。为植物在复合重金属土壤污染耐性机制研究提供参考,为生物工程治理修复重金属土壤污染提供理论依据。主要研究结果如下：(1)在不同浓度铅锌胁迫条件下,普陀山苔草根亚细胞组分中铅锌含量均大于叶片亚细胞组分中铅锌含量。普陀山苔草叶片和根各亚细胞组分中铅含量分布均呈现出,细胞壁组分(F1)>可溶性组分(F3)>细胞膜及细胞器组分(F2),而锌含量分布均呈现出,可溶性组分(F3)>细胞壁组分(F1)>细胞膜及细胞器组分(F2)。铅锌复合处理下,铅浓度越高,普陀山苔草亚细胞叶片各组分铅含量随着铅浓度的升高而升高,细胞壁组分(F1)中的锌含量随着铅浓度的升高而升高,可溶性组分(F3)中的锌含量却随着铅浓度的升高而降低。不同重金属离子通过不同的方式积累在不同的亚细胞组分中,且铅可能在一定程度上能抑制锌进入普陀山苔草细胞内,降低锌对细胞的毒害作用。(2)在不同浓度铅锌胁迫条件下,普陀山苔草叶片的超氧化物歧化酶(SOD)活性均高于过氧化氢酶(CAT)活性,且SOD活性下降时,CAT活性增加。说明由于SOD与CAT不同活性氧的清除功能,在普陀山苔草抗氧化过程中所起到的不同的作用。谷胱甘肽还原酶(GR)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性均随着处理浓度的升高呈现先升高后降低的趋势,但GR活性变化差异显著高于APX活性变化,说明这两种酶均具有低促高抑的特性,但GR在普陀山苔草抗氧化作用中与APX相比,更为活跃。抗坏血酸(AsA)与还原性谷胱甘肽(GSH)相同,都是在低浓度的铅锌胁迫下诱导合成,又在高浓度铅锌胁迫下大量消耗,但GSH含量的变化差异高于AsA含量变化差异。说明GSH在普陀山苔草抗氧化过程中发挥着更重要的作用。(3)通过同源克隆的方法,以龙葵SorMT2基因的简并引物进行PCR扩增,获得了普陀山苔草CpMT2基因的保守片段,长度为237bp。NCBI上BLAST比对发现获得的片段氨基酸序列与大部分植物同一性都在70%以上;利用CODEHOP软件,以四条GCS氨基酸序列(GenBank中登录号分别为：ACK38262.1、CAD48599.3、CAC83005.1、CAC83005.1)设计12对简并引物,通过PCR筛选出一对最优引物,获得了普陀山苔草CpGCS的保守片段,长度为438bp。NCBI上BLAST比对发现获得的片段氨基酸序列与大部分植物同一性都在90%以上。(4)通过实时荧光定量PCR技术,建立CpMT2基因的荧光定量体系,测定在不同浓度铅锌胁迫下CpMT2基因的表达量。通过对CpMT2表达量分析发现：在铅浓度为600mg/L时,CpMT2表达量达到最高,为对照组的3.49倍;在锌浓度为250mg/L时,CpMT2表达量达到最低,为对照组的0.15倍。与Pb600mg/L相比,Pb600mg/L、 Zn250mg/L复合处理下CpMT2表达量下降了22.3倍。铅能显著的促进CpMT2的表达;低浓度的锌会促进CpMT2的表达,但高浓度的锌却会极显著抑制CpMT2的表达。(5)通过实时荧光定量PCR技术,建立CpGCS的荧光定量体系,测定在不同浓度铅锌胁迫下CpGCS的表达量。通过对CpGCS表达量分析发现：在处理浓度为600mg/L时,CpGCS表达量达到最大值,为对照组的29.5倍。在锌浓度为250mg/L时,CpGCS表达量达到最低,为对照组的0.23倍;与锌浓度250mg/L相比,Pb600mg/L、Zn250mg/L处理下CpGCS的表达量升高了6.53倍。铅锌单一胁迫下,CpGCS表达量随着浓度的升高呈先升高后降低的趋势,而在复合胁迫下,与单一锌胁迫相比,铅的加入提高了CpGCS表达。

关键词：普陀山苔草抗氧化系统亚细胞金属硫蛋白 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶

铅锌胁迫下普陀山苔草（Carex putuoshanensis sp.）的富集特性及生理代谢研究

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铅锌胁迫下普陀山苔草（Carex putuoshanensis sp.）的富集特性及...

作者：黄金龙四川农业大学

学位级别：硕士

本文以课题组前期在雅安汉源县普陀山铅锌矿区发现的苔草属一新种普陀山苔草(Carex putuoshanensis sp.)为研究材料,通过人工砂培控制性试验研究了铅、锌单一及复合处理对普陀山苔草生长状况、铅锌富集特性、生理代谢等方面的影响,并探... 详细信息

本文以课题组前期在雅安汉源县普陀山铅锌矿区发现的苔草属一新种普陀山苔草(Carex putuoshanensis sp.)为研究材料,通过人工砂培控制性试验研究了铅、锌单一及复合处理对普陀山苔草生长状况、铅锌富集特性、生理代谢等方面的影响,并探讨了普陀山苔草在铅锌胁迫下的生理代谢机制。主要研究结果如下：(1)在砂培条件下,普陀山苔草对铅有很高的耐性,而对锌的耐性较低。在单一铅处理下(铅浓度范围200～600mg/L),株高、根长、生物量均呈一定的增加趋势。铅浓度为600mg/L时,生物量达到最大值14.49g/盆。而铅浓度为800mg/L～2000mg/L范围时,株高、根长、生物量则均呈降低的趋势,但未有明显的受害症状。在单一锌处理下(锌浓度范围50～850mg/L),株高、根长、生物量均表现出降低的趋势,且受害症状明显。在锌浓度为250mg/L时,生物量降低到最小值2.86g/盆,并出现死亡迹象,达到致死浓度。在铅锌复合处理下,当锌浓度≤125mg/L和铅浓度≤600mg/L时,对普陀山苔草生长有一定的促进作用,在铅浓度为200mg/L和锌浓度为50mg/L时,生物量达到最大值17.44g/盆。(2)在单一铅处理下(铅浓度范围200～600mg/L),根系活力、叶绿素总量、叶片可溶性糖含量均呈上升的趋势。在铅浓度为600mg/L时,均达到最大值,分别为261.70μgTTF/(g·h)、1.96mg/g·FW、228.10 mmol/kg·FW,提高了普陀山苔草对铅的耐受能力。而在单一锌处理下(锌浓度范围50～250mg/L),根系活力、叶绿素总量均呈明显的下降趋势。在锌浓度为250mg/L,分别下降到最小值159.76μgTTF/(g·h)、0.70 mg/g·FW,且叶片相对电导率和MDA含量分别比对照增加了100.36%、87%。铅锌复合处理下,当锌浓度≤125mg/L和铅浓度≤600mg/L时,铅锌的复合在一定程度上减轻了锌对根系活力、叶绿素总量以及叶片膜透性的伤害作用。(3)在砂培条件下,单一铅浓度为2000mg/L时,普陀山苔草地上和地下部分铅含量分别达到1046.43、2268.68mg/kg。而在铅锌复合处理下,一定浓度的锌能促进普陀山苔草对铅的吸收和富集,甚至能达到铅超富集标准。在锌浓度为125mg/L和铅浓度为600mg/L时,普陀山苔草地上和地下部分铅含量均达到最大值,分别为2369.26mg/kg、2187.72 mg/kg,铅转运系数达到1.08,地上和地下部分铅富集系数分别达到3.95、3.65,达到并超过了铅超富集植物的标准。由此可认为,普陀山苔草是一种新的铅超富集植物。(4)在铅、锌单一及复合处理下,SOD、CAT、GSH的抗氧化作用不同。在单一铅处理下(铅浓度范围200～600mg/L),SOD活性呈上升的趋势,而CAT活性和GSH含量均呈下降的趋势。单一锌处理下(锌浓度范围50～250mg/L),SOD活性呈下降趋势,而CAT活性和GSH含量均呈上升的趋势。铅锌复合处理下,当锌浓度≤250mg/L和铅浓度≤600mg/L,SOD活性呈下降的趋势,而CAT活性和GSH含量均呈上升的趋势。在锌浓度为250mg/L和铅浓度为600mg/L时,SOD下降到最低值155U/g·FW、叶的GSH含量达到最大值432.30nmol/g。(5)螯合作用在普陀山苔草应对铅锌胁迫中发挥着重要作用。在单一铅处理下(铅浓度范围200-600mg/L),普陀山苔草根和叶的植物螯合肽(PCs)含量均呈增加的趋势。在铅浓度为600mg/L,分别达到最大值384.83 nmol/g、353.76 nmol/g。而在单一锌处理下(锌浓度范围50-250mg/L),根和叶的PCs含量均呈下降趋势。在铅锌复合处理下,当锌浓度≤125mg/L和铅浓度≤600mg/L时,根和叶的PCs含量呈增加的趋势。在锌浓度为50mg/L和铅浓度为600mg/L,根和叶的PCs含量分别均达到最大值410.28 nmol/g、461.67 nmol/g。研究结果表明普陀山苔草对铅有着很高的耐性,且在一定浓度锌作用下表现出铅超富集的能力。这不仅丰富了铅超富集植物种类资源和遗传多样性,而且还发现了锌对植物体富集铅能力的调控新途径,这对植物修复技术的构建具有一定的理论和应用价值。

关键词：普陀山苔草铅超富集植物生理代谢植物螯合肽

铅锌胁迫下普陀山苔草（Carex putuoshan）植物络合素合酶基因应答初步研究

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铅锌胁迫下普陀山苔草（Carex putuoshan）植物络合素合酶基因应...

作者：胡永霖四川农业大学

学位级别：硕士

植物在进化过程中形成了一系列重金属胁迫的响应机制,植物络合素(Phytochelations,PCs))即是其中之一,它在植物响应重金属胁迫过程中发挥着重要的作用。植物络合素(PCs)不是由基因直接编码合成,而是由植物络合素合成酶(Phytochelatin sy... 详细信息

植物在进化过程中形成了一系列重金属胁迫的响应机制,植物络合素(Phytochelations,PCs))即是其中之一,它在植物响应重金属胁迫过程中发挥着重要的作用。植物络合素(PCs)不是由基因直接编码合成,而是由植物络合素合成酶(Phytochelatin synthase,PCS)催化完成。本课题选取铅超富集植物普陀山苔草(Carex putuoshan)为对象,以非富集植物金叶苔草(Carex Evergold)为对照,通过铅锌胁迫处理,研究胁迫条件下普陀山苔草的应答模式,特别是通过植物络合素合酶基因在铅锌胁迫下不同时间的组织表达特点,以及该基因的结构、进化关系及蛋白三维结构的系统研究,从而对普陀山苔草铅超富集的分子机制进行探讨,为铅锌重金属污染土修复的植物培育奠定基础。主要结论如下：(1)实时荧光定量PCR分析结果显示,铅锌胁迫下普陀山苔草植物络合素合酶基因(CpPCS)及金叶苔草植物络合素合酶基因(CePCS)表达量均升高,CpPCS的表达模式是普陀山苔草超富集铅机制的重要组成部分。铅(600mg/L)、锌(125mg/L)、铅锌复合(Pb 600mg/L;Zn 125mg/L)胁迫下,CpPCS及CePCS在叶中的表达量显著增加,远大于在根中的增加量,这解释了普陀山苔草地上部分铅富集量高于地下部分;铅(600mg/L)、锌(125mg/L)、铅锌复合(Pb 600mg/L;Zn125mg/L)胁迫下,CpPCS及CePCS的表达量大部分随着时间变化呈现先升高后略微降低再升高的趋势;研究表明：铅锌复合(Pb 600mg/L;Zn 125mg/L)胁迫36h后,普陀山苔草叶片CpPCS基因表达量达空白对照组的12倍,是同期处理条件下金叶苔草CePCS表达量的8倍,其CpPCS蛋白酶活也是CePCS的8倍。故CpPCS蛋白催化合成的PCs结合铅离子的量远高于CePCS蛋白,这是普陀山苔草铅超富集的酶活重要特征。(2)普陀山苔草植物络合素合成酶基因克隆及编码蛋白结构研究表明：普陀山苔草CpPCS基因的开放阅读框由1461个碱基组成,编码一个含有486个氨基酸残基的蛋白,其等电点为6.12,分子量为53.86Kda,预测脂肪系数为87.65,不稳定系数为47.56,为不稳定蛋白,亚细胞定位预测CpPCS蛋白定位于细胞核。经BLAST比对发现,普陀山苔草络合素合酶结构域,与玉米、芦苇、大蒜、粉蓝烟草的PCS氨基酸序列相似性分别为64%、63%、63%、63%。CpPCS有19个半胱氨酸(Cys)残基散布在蛋白的不同区域上,并组合成五个Cys-(Xaa)n-Cys(n=0-5)元件,这些元件是响应铅锌胁迫的重要功能元件。预测CpPCS蛋白的亲水性平均系数为-0.094,所以为亲水性蛋白。CpPCS蛋白有两个跨膜区域。从普陀山苔草CpPCS蛋白的三维结构预测看,与拟南芥AtPCS1蛋白、蜈蚣草PvPCS蛋白以及印度芥菜BjPCS1蛋白三维结构比较,具类似空间结构。进化树构建表明：普陀山苔草CpPCS与狗牙根及芦苇等单子叶植物亲缘关系最近。

关键词：普陀山苔草铅锌胁迫植物络合素合酶及基因应答模式

铅锌胁迫下普陀山苔草（Carex putuoshan）根的差异蛋白质表达特点研究

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铅锌胁迫下普陀山苔草（Carex putuoshan）根的差异蛋白质表达特...

作者：谭家郎四川农业大学

学位级别：硕士

本课题组在雅安汉源县普陀山铅锌矿区发现一种新铅超富集植物一普陀山苔草(Carex putuoshan)。该植物在铅锌复合污染土中,表现出繁殖力强、生物量大、耐瘠等特点。鉴于此,为进一步探讨该植物的铅超富集机制,寻找其铅超富集应答蛋白元件... 详细信息

本课题组在雅安汉源县普陀山铅锌矿区发现一种新铅超富集植物一普陀山苔草(Carex putuoshan)。该植物在铅锌复合污染土中,表现出繁殖力强、生物量大、耐瘠等特点。鉴于此,为进一步探讨该植物的铅超富集机制,寻找其铅超富集应答蛋白元件,本试验以普陀山苔草为研究对象,通过铅锌复合胁迫,运用差异蛋白质组学原理,采用双向凝胶电泳法、质谱分析以及生物信息学技术,对铅锌复合胁迫条件下的普陀山苔草根的差异表达蛋白进行了系统研究,其结果如下：(1)在已有研究基础上,获得适合普陀山苔草根的双向凝胶电泳体系,包括蛋白供试品的提取方法的选择,获得了蛋白点376个,电泳图谱清晰。(2)对其中表达量最突出的10个蛋白质进行质谱鉴定,鉴定成功9个,包括7个不同蛋白,2个重复检出蛋白,1个功能未知蛋白,质谱鉴定为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)、烯醇化酶(enolase)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)、异黄酮还原酶(IFR)、植物络合素合酶(PCS)7个酶蛋白质。(3)对鉴定出的蛋白进行生物信息分类,发现其主要定位于细胞质中;主要参与氧化还原过程和糖代谢相关过程;多数被鉴定的蛋白质酶具氧化还原活性。上述研究表明,普陀山苔草铅超富集过程是一个庞大的酶活系统工程,其代谢主要涉及糖代谢和能量代谢,参与最为活跃的是两大酶系即己糖裂解酶系和磷酸戊糖酶系,其中甘油醛-3-磷酸脱氢酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶尤其突出,因此,该两个酶可以作为普陀山苔草根铅锌复合胁迫下的关键应答元件蛋白代表,即通过对甘油醛-3-磷酸脱氢酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶表达量变化,作为普陀山苔草铅超富集变化的重要指标,其蛋白质分子量分别为约14.7kDa和35.91kDa。

关键词：普陀山苔草铅锌复合胁迫双向电泳应答元件蛋白