铅锌胁迫下普陀山苔草（Carex putuoshan）植物络合素合酶基因应答初步研究

作     者：胡永霖 

作者单位：四川农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：朱雪梅

授予年度：2016年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：普陀山苔草 铅锌胁迫 植物络合素合酶及基因 应答模式 

摘      要：植物在进化过程中形成了一系列重金属胁迫的响应机制,植物络合素(Phytochelations,PCs))即是其中之一,它在植物响应重金属胁迫过程中发挥着重要的作用。植物络合素(PCs)不是由基因直接编码合成,而是由植物络合素合成酶(Phytochelatin synthase,PCS)催化完成。本课题选取铅超富集植物普陀山苔草(Carex putuoshan)为对象,以非富集植物金叶苔草(Carex Evergold)为对照,通过铅锌胁迫处理,研究胁迫条件下普陀山苔草的应答模式,特别是通过植物络合素合酶基因在铅锌胁迫下不同时间的组织表达特点,以及该基因的结构、进化关系及蛋白三维结构的系统研究,从而对普陀山苔草铅超富集的分子机制进行探讨,为铅锌重金属污染土修复的植物培育奠定基础。主要结论如下：(1)实时荧光定量PCR分析结果显示,铅锌胁迫下普陀山苔草植物络合素合酶基因(CpPCS)及金叶苔草植物络合素合酶基因(CePCS)表达量均升高,CpPCS的表达模式是普陀山苔草超富集铅机制的重要组成部分。铅(600mg/L)、锌(125mg/L)、铅锌复合(Pb 600mg/L;Zn 125mg/L)胁迫下,CpPCS及CePCS在叶中的表达量显著增加,远大于在根中的增加量,这解释了普陀山苔草地上部分铅富集量高于地下部分;铅(600mg/L)、锌(125mg/L)、铅锌复合(Pb 600mg/L;Zn125mg/L)胁迫下,CpPCS及CePCS的表达量大部分随着时间变化呈现先升高后略微降低再升高的趋势;研究表明：铅锌复合(Pb 600mg/L;Zn 125mg/L)胁迫36h后,普陀山苔草叶片CpPCS基因表达量达空白对照组的12倍,是同期处理条件下金叶苔草CePCS表达量的8倍,其CpPCS蛋白酶活也是CePCS的8倍。故CpPCS蛋白催化合成的PCs结合铅离子的量远高于CePCS蛋白,这是普陀山苔草铅超富集的酶活重要特征。(2)普陀山苔草植物络合素合成酶基因克隆及编码蛋白结构研究表明：普陀山苔草CpPCS基因的开放阅读框由1461个碱基组成,编码一个含有486个氨基酸残基的蛋白,其等电点为6.12,分子量为53.86Kda,预测脂肪系数为87.65,不稳定系数为47.56,为不稳定蛋白,亚细胞定位预测CpPCS蛋白定位于细胞核。经BLAST比对发现,普陀山苔草络合素合酶结构域,与玉米、芦苇、大蒜、粉蓝烟草的PCS氨基酸序列相似性分别为64%、63%、63%、63%。CpPCS有19个半胱氨酸(Cys)残基散布在蛋白的不同区域上,并组合成五个Cys-(Xaa)n-Cys(n=0-5)元件,这些元件是响应铅锌胁迫的重要功能元件。预测CpPCS蛋白的亲水性平均系数为-0.094,所以为亲水性蛋白。CpPCS蛋白有两个跨膜区域。从普陀山苔草CpPCS蛋白的三维结构预测看,与拟南芥AtPCS1蛋白、蜈蚣草PvPCS蛋白以及印度芥菜BjPCS1蛋白三维结构比较,具类似空间结构。进化树构建表明：普陀山苔草CpPCS与狗牙根及芦苇等单子叶植物亲缘关系最近。