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非洲马瘟病毒VP7蛋白在昆虫细胞中的表达及其抗体制备

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中国兽医科学 2022年第3期52卷 317-323页

作者：户鑫兵高闪电田占成范亚亚关贵全刘光远罗建勋殷宏独军政中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

为了表达非洲马瘟病毒(AHSV)VP7蛋白并制备其多克隆抗体,参考GenBank中已公开的AHSV基因序列,人工合成编码AHSV-1 VP7蛋白的S7基因全长序列,利用PCR技术扩增得到S7基因片段,将其克隆到p FastBac^(TM)HTb载体上,构建重组载体p FastBac^(T... 详细信息

为了表达非洲马瘟病毒(AHSV)VP7蛋白并制备其多克隆抗体,参考GenBank中已公开的AHSV基因序列,人工合成编码AHSV-1 VP7蛋白的S7基因全长序列,利用PCR技术扩增得到S7基因片段,将其克隆到p FastBac^(TM)HTb载体上,构建重组载体p FastBac^(TM)-AHSVS7,通过蓝白斑试验筛选出重组杆粒BacmidAHSVS7,并转染昆虫细胞,拯救获得重组杆状病毒。SDS-PAGE和Western-blot结果显示,AHSV-1 VP7重组蛋白在昆虫细胞中获得表达。利用组氨酸标签纯化树脂获得了高纯度的VP7蛋白,将其免疫新西兰大白兔制备相应的多克隆抗体,该抗体不仅能与杆状病毒重组表达的AHSV-1 VP7蛋白反应,且能识别BHK21细胞中表达的AHSV-1 VP7蛋白,具有很好的特异性。本试验成功利用杆状病毒系统表达了AHSV-1 VP7重组蛋白,并制备了多克隆抗体,这为后续AHSVVP7蛋白功能的研究以及ELISA诊断方法的建立奠定了基础。

关键词：非洲马瘟病毒 VP7蛋白昆虫细胞表达多克隆抗体

蜱IgG结合蛋白的昆虫细胞表达及结合IgG特性分析

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寄生虫与医学昆虫学报 2012年第4期19卷 235-240页

作者：秦顺晴曹杰周勇志张厚双周金林中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点实验室上海200241

蜱吸食宿主大量血液，其中宿主血液中IgG分子能穿过蜱肠道，进入血淋巴，且能保持其活性。为逃避宿主免疫攻击，蜱唾液腺分泌一种免疫球蛋白结合蛋白（ImmunoglobulinGbindingprotein，IGBP），与蜱体内的宿主IgG结合，抑制宿主IgG对蜱... 详细信息

蜱吸食宿主大量血液，其中宿主血液中IgG分子能穿过蜱肠道，进入血淋巴，且能保持其活性。为逃避宿主免疫攻击，蜱唾液腺分泌一种免疫球蛋白结合蛋白（ImmunoglobulinGbindingprotein，IGBP），与蜱体内的宿主IgG结合，抑制宿主IgG对蜱的损害，是蜱唾液腺重要的功能分子，也是抗蜱疫苗候选分子。镰形扇头蜱是我国南方的优势蜱种，其唾液腺免疫球蛋白结合蛋白（***）被鉴定为抗蜱免疫保护性抗原，为进一步了解其生物学功能，本研究应用杆状病毒表达系统，构建出重组杆粒***，并在昆虫细胞中表达出真核重组蛋白RH-IGBP，经免疫荧光实验鉴定和Westernblot分析，重组蛋白大小为23kDa，与预期一致。重组蛋白经纯化，利用ELISA方法，研究重组蛋白与不同哺乳动物宿主（兔、猪、牛羊、鼠、犬）和人的IgG结合能力，发现RH·IGBP与不同宿主IgG结合能力不同，与兔、猪的IgG有明显结合能力。对来自兔源IgG不同酶切片段F（ab’）2和Fc与***结合特性分析表明，蜱IgG结合蛋白主要识别部位是IgG的F（ab’）2片段。这些结果初步揭示了蜱IgG结合蛋白的作用机制和特点。

关键词：免疫球蛋白结合蛋白昆虫细胞表达镰形扇头蜱

猪圆环病毒2型ORF2基因在昆虫细胞中的表达及其特性

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生物工程学报 2005年第6期21卷 975-978页

作者：樊惠英陈焕春佟铁铸琚春梅吕建强黄红亮华中农业大学动物医学院动物病毒室武汉430070

利用BactoBac杆状病毒表达系统将圆环病毒2型的ORF2全基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBacTM1中,获得重组转移载体pFastOFR2,再将其转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,发生转座作用,经蓝白菌落筛选得到含ORF2基因的重组穿梭... 详细信息

利用BactoBac杆状病毒表达系统将圆环病毒2型的ORF2全基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBacTM1中,获得重组转移载体pFastOFR2,再将其转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,发生转座作用,经蓝白菌落筛选得到含ORF2基因的重组穿梭载体***2,以脂质体介导的方法将重组穿梭载体转染sf9细胞,获得重组病毒,命名为***2。间接免疫荧光分析表明,PCV2阳性血清能使***2感染的sf9昆虫细胞呈强的荧光着色;SDSPAGE与Westernblotting分析可见大小约为28kD的特异性带,表明***2在sf9细胞中成功表达了PCV2ORF2蛋白。将该表达蛋白纯化并经磷钨酸负染后,通过电镜观察可见形态与PCV2病毒粒子相似的病毒样颗粒(VLPs),其中某些颗粒由于中心浓染而似空衣壳,其直径也为17nm左右。

关键词：猪圆环病毒2型 ORP2蛋白昆虫细胞表达病毒样颗粒

犬干扰素α2与犬白蛋白融合基因在昆虫细胞中的表达与活性分析

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畜牧兽医学报 2019年第10期50卷 2113-2118页

作者：王晶宇欧阳伟钱晶王晓丽夏兴霞诸玉梅毕振威王永山江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室

本研究旨在利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达具有生物活性的犬白蛋白-犬干扰素α2(albumin-CaIFN-α2)。将蜂素信号肽(HBM)、犬血清白蛋白(Alb)与犬干扰素α2的融合基因经密码子优化后,连接至转移载体pFastBac1中,获得了重组pFastBac... 详细信息

本研究旨在利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达具有生物活性的犬白蛋白-犬干扰素α2(albumin-CaIFN-α2)。将蜂素信号肽(HBM)、犬血清白蛋白(Alb)与犬干扰素α2的融合基因经密码子优化后,连接至转移载体pFastBac1中,获得了重组pFastBac1-HBM-Alb-CaIFN-α2,将重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,经过三次蓝白斑筛选纯化,得到的重组穿梭质粒rBac-HBM-Alb-CaIFN-α2转染Sf9细胞,72 h后可观察到明显的细胞病变。用第三代重组杆状病毒rBac-HBM-Alb-CaIFN-α2感染Sf9昆虫细胞,感染3 d后,收获昆虫细胞和细胞培养物,间接免疫荧光(IFA)结果显示,重组杆状病毒感染的细胞呈现绿色荧光;Western blot检测结果显示,在约90 ku左右可观察到特异性条带,证实重组Alb-CaIFN-α2能够在昆虫细胞中表达。利用MDCK/VSV微量细胞病变抑制法检测重组Alb-CaIFN-α2的抗病毒活性,结果显示重组Alb-CaIFN-α2的活性为1.70×10 6 U·mL^-1,为进一步研究新型犬用干扰素制品奠定了试验基础。

关键词：犬干扰素α2 犬血清白蛋白昆虫细胞表达抗病毒活性

抗对硫磷单链抗体在昆虫细胞中的表达及活性鉴定

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农药学学报 2016年第2期18卷 177-184页

作者：刘蕊项丹丹刘鹏琰梁晓郭逸蓉朱国念浙江大学农药与环境毒理研究所杭州310058 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所海口571101

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,在Sf9昆虫细胞中表达抗对硫磷单链抗体,并评价该重组抗体sc Fv-4C6的分子识别活性。以分泌能特异性识别对硫磷的单克隆抗体的杂交瘤细胞株4C6为RNA来源,采用RT-PCR方法扩增抗体的重链和轻链可变区基因,... 详细信息

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,在Sf9昆虫细胞中表达抗对硫磷单链抗体,并评价该重组抗体sc Fv-4C6的分子识别活性。以分泌能特异性识别对硫磷的单克隆抗体的杂交瘤细胞株4C6为RNA来源,采用RT-PCR方法扩增抗体的重链和轻链可变区基因,经重叠延伸PCR方法串联拼接获得单链抗体基因片段(sc Fv-4C6)。构建包含目的片段的重组杆粒Bacmidsc Fv-4C6,转染Sf9细胞表达目的蛋白,采用免疫印迹法(Western blotting)检测表达产物,间接竞争酶联免疫吸附(ic-ELISA)法评价产物的生物活性。结果表明:sc Fv-4C6基因片段拼装正确,成功转染Sf9细胞,并在转染后72 h表达量最高,表达的单链抗体大小为28.3 k D;表达产物能特异性识别对硫磷,IC50值为7.9 ng/m L,对甲基对硫磷和杀螟硫磷分别有12%和1.8%的交叉反应率,与亲本单克隆抗体的识别性能相似。该研究表明,具有生物活性的抗对硫磷单链抗体sc Fv-4C6可在昆虫细胞中成功得到表达。

关键词：对硫磷单链抗体昆虫细胞表达酶联免疫吸附

WSSV ie1的野生型和突变体在昆虫细胞中的表达及其蛋白纯化

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水生生物学报 2012年第1期36卷 152-155页

作者：马国达王茜于力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 黑龙江八一农垦大学生命科学与技术学院大庆163319

对虾白斑综合征（White Spot Syndrome,WSS）是由对虾白斑综合征病毒（White Spot Syndrome Virus,WSSV）引起的,该病毒是目前世界范围内对虾养殖业的主要病原,它感染的宿主种类多,分布范围广,传播速度快。对虾被感染后,3—10d内累积死... 详细信息

对虾白斑综合征（White Spot Syndrome,WSS）是由对虾白斑综合征病毒（White Spot Syndrome Virus,WSSV）引起的,该病毒是目前世界范围内对虾养殖业的主要病原,它感染的宿主种类多,分布范围广,传播速度快。对虾被感染后,3—10d内累积死亡率可达90%—100%[1,2],目前尚无有效的预防和治疗该病的药物，给对虾养殖业造成巨大损失。

关键词： WSSV ie1 突变体昆虫细胞表达纯化

汉坦病毒G2糖蛋白在昆虫细胞中的表达及其在免疫诊断中的应用

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中国媒介生物学及控制杂志 2005年第3期16卷 199-201页

作者：朱国献朱函坪梁伟峰姚苹苹朱智勇浙江省杭州市第六人民医院传染科杭州310014 浙江省疾病预防控制中心

目的构建汉坦病毒(HV)Z10株包膜糖蛋白G2基因的重组表达载体,探索其在昆虫细胞中的表达及在免疫荧光诊断中的应用。方法以质粒pUCmZ10M为模板设计引物,用聚合酶链反应(PCR)扩增Z10株G2基因片段,将G2片段克隆入pUCmT质粒载体,碱法提取质... 详细信息

目的构建汉坦病毒(HV)Z10株包膜糖蛋白G2基因的重组表达载体,探索其在昆虫细胞中的表达及在免疫荧光诊断中的应用。方法以质粒pUCmZ10M为模板设计引物,用聚合酶链反应(PCR)扩增Z10株G2基因片段,将G2片段克隆入pUCmT质粒载体,碱法提取质粒pUCmZ10G2,酶切后将回收片段插入杆状病毒转移载体pFastBacHTa,构建重组体pFastBacHTaZ10G2,重组体转化感受态细胞***10Bac后,经2轮筛选,提取重组质粒转染昆虫细胞sf9,并用间接免疫荧光技术检测表达的G2蛋白。结果获得含有编码HVZ10株的包膜糖蛋白G2基因的重组质粒,转染昆虫细胞表达出G2蛋白,与肾综合征出血热(HFRS)阳性血清反应,昆虫细胞内呈现特异性环状荧光。检测40份HFRS血清,与全病毒细胞抗原片的符合率为95%。结论成功构建HVZ10株包膜糖蛋白G2基因的表达载体,并在昆虫细胞中表达。可利用重组G2蛋白检测HV感染。

关键词：汉坦病毒 G2 免疫诊断应用杆状病毒转移载体包膜糖蛋白肾综合征出血热重组表达载体免疫荧光诊断聚合酶链反应 E.coli 间接免疫荧光昆虫细胞表达感受态细胞模板设计基因片段质粒载体碱法提取质粒转染技术检测

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昆虫细胞表达功能性HLA-DR4

生物技术通报 1993年第5期9卷 14-14页

作者：孙国凤

瑞士 Hoffmam-la Roche 公司用昆虫细胞表达人二级主要组织适合基因复合体（MHC）抗原的HLA-DR4分子,使昆虫细胞发挥人的抗原提示细胞机能。美国 Roche 公司副经理兼生物技术研究组组长 Michael Steinmetz 在9月19日东京召开的第二届罗... 详细信息

瑞士 Hoffmam-la Roche 公司用昆虫细胞表达人二级主要组织适合基因复合体（MHC）抗原的HLA-DR4分子,使昆虫细胞发挥人的抗原提示细胞机能。美国 Roche 公司副经理兼生物技术研究组组长 Michael Steinmetz 在9月19日东京召开的第二届罗希讨论会上发表了其概要。研究详情近期在 Journ-

关键词：昆虫细胞表达 HLA-DR4 Roche 基因复合体基因序列公司副经理生物技术补体调节因子核多角体病毒结合部位

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世界首创用昆虫细胞表达重组猪卵泡刺激激素

生物技术通报 1995年第3期11卷 19-19页

作者：孙国凤

群马大学生理活性物质中心助教授加藤幸雄小组用昆虫细胞表达重组猪卵泡刺激激素(FSH),确认重组FSH具有与天然FSH相同的生物活性。据说目前有用人、牛生产重组FSH的,但是用猪生产重组FSH是世界首创。得到了纯度高的FSH。它除对卵泡刺激... 详细信息

群马大学生理活性物质中心助教授加藤幸雄小组用昆虫细胞表达重组猪卵泡刺激激素(FSH),确认重组FSH具有与天然FSH相同的生物活性。据说目前有用人、牛生产重组FSH的,但是用猪生产重组FSH是世界首创。得到了纯度高的FSH。它除对卵泡刺激激素的机能和作用机制的分析有用外,还能应用于猪体外受精系统的研究。于10日2～8日在新泻召开的日本畜产学会上发表了这项成果。群马大学与日生研、大阪府立大学、东北农业试验场、冈山大学合作,在一个杆状病毒载体上插入了FSH的α链和β链两个基因,使昆虫细胞Tn5感染。

关键词：昆虫细胞表达猪卵泡卵泡刺激激素杆状病毒载体生产重组体外受精作用机制生物活性东北农业畜产学