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中国老年学杂志 2021年第8期41卷 1682-1686页

作者：邸畅李国萍罗浩丹毕珊孙欣陈绍春昆明医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系云南昆明650500 昆明医科大学第三附属医院头颈外科云南昆明650500 昆明医科大学康复学院云南昆明650500

目的在人神经元样细胞SY5Y中激活和抑制环磷酸腺苷(cAMP)反应元件结合蛋白(CREB)的磷酸化,检测γ分泌酶复合体蛋白及β淀粉样蛋白前体(APP)水平的变化,分析通过调控CREB磷酸化防治阿尔茨海默病(AD)的可行性。方法培养空载体SY5Y细胞(Vec... 详细信息

目的在人神经元样细胞SY5Y中激活和抑制环磷酸腺苷(cAMP)反应元件结合蛋白(CREB)的磷酸化,检测γ分泌酶复合体蛋白及β淀粉样蛋白前体(APP)水平的变化,分析通过调控CREB磷酸化防治阿尔茨海默病(AD)的可行性。方法培养空载体SY5Y细胞(Vector-SY5Y)、过表达Gαq(Gαq-SY5Y)细胞、过表达APP(APP-SY5Y)细胞,分别用cAMP激动剂Forskolin、蛋白激酶(PK)A受体抑制剂H 892HCL处理上述3种细胞,Western印迹检测APP及γ分泌酶复合体的蛋白成分早老素增强子(PEN2)及早老素C端(PS1-CTF)的水平变化。结果①在Vector-SY5Y细胞中,激动剂组APP的表达无明显变化,PEN2、PS1-CTF表达明显上调;抑制剂组APP的表达明显上调,PEN2、PS1-CTF变化不明显。②在Gαq-SY5Y细胞中,激动剂组APP明显下降,PEN2表达量明显上调,PS1-CTF明显下降;抑制剂组APP明显下降,PEN2明显下调,PS1-CTF无明显变化。③在APP-SY5Y细胞中,激动剂组APP变化不明显,PEN2表达明显上调,PS1-CTF表达明显下降;抑制剂组APP明显上升,PEN2表达明显下降,PS1-CTF明显上调。结论激活CREB的磷酸化可上调γ分泌酶复合体中PEN2水平,协同过表达Gαq可明显降低APP水平,可设计基于CREB和Gαq的AD防治策略。

关键词： β淀粉样蛋白前体 γ分泌酶早老素1 早老素增强子2 环磷酸蛋白反应元件结合蛋白

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调节CREB磷酸化水平对APP和γ分泌酶的影响及其在AD防治中的意义

调节CREB磷酸化水平对APP和γ分泌酶的影响及其在AD防治中的意义

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作者：邸畅昆明医科大学

学位级别：硕士

[目的]β淀粉样蛋白前体蛋白（β-amyloid precursor protein,APP）代谢状态在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）发生发展中发挥起着重要作用。APP的增多是β淀粉样蛋白（Amyloid β-protein）增多进而产生沉淀的必然阶段。在AD... 详细信息

[目的]β淀粉样蛋白前体蛋白（β-amyloid precursor protein,APP）代谢状态在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）发生发展中发挥起着重要作用。APP的增多是β淀粉样蛋白（Amyloid β-protein）增多进而产生沉淀的必然阶段。在AD病人和过表达APP的转基因鼠中环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein,CREB）的磷酸化下调,而上调CREB的磷酸化水平是否能逆转APP的表达,影响γ分泌酶中早老素-1（Preselin 1,PS1）和早老素增强子2（Preselinenhencer2,PEN2）尚不清楚。本研究主要目的是通过在人神经元样细胞SH-SY5Y中过表达APP和G蛋白α亚单位q（Gaq）,并激活和抑制CREB,检测PS1、PEN2等AD相关蛋白的变化,分析通过调控CREB防治AD的可行性。[方法]（1）培养入神经母细胞瘤（SH-SY5Y）细胞,分别为:过表达Gαq（Gαq-SY5Y）细胞、空载体 SY5Y 细胞（Vector-SY5Y）、过表达 APP（APP-SY5Y）细胞。利用Western Blot实验检测APP及γ分泌酶复合体的蛋白成分变化。（2）根据所购买试剂的推荐浓度Forskolin环磷酸腺苷（cAMP）激动剂35谬μmol,H89 2 HCL蛋白激酶A（PKA）受体抑制剂30μmol,分别作用于上述三种不同细胞,37℃培养箱中处理一个小时。每组细胞分为三种处理,激活CREB组、抑制CREB组及对照组。利用Western Blot实验检测APP及Y分泌酶复合体的蛋白成分的变化。（3）观察CREB激动剂、抑制剂处理后细胞的形态变化。[结果]（1）Western Blot结果显示:Gαq-SY5Y细胞中磷酸化的CREB水平较Vectior-SY5Y细胞及APP-SY5Y细胞明显增高,APP-SY5Y细胞中的磷酸化CREB水平明显低于Vectior-SY5Y细胞。（2）γ分泌酶复合体的组成成分中早老素增强子（PEN2）及早老素C端（PS1-CTF）表达量亦在Gαq-SY5Y细胞中明显升高。（3）Western Blot结果显示:在激活CREB组PEN2及PS1-CTF的表达量较对照组及抑制CREB组均增高,抑制CREB组两种蛋白低于对照组,但是APP表达量升高。（4）激活CREB可加快Gαq-SY5Y细胞、APP-SY5Y细胞的生长速度,改善细胞的老化状态;抑制CREB则减缓Gαq-SY5Y细胞、APP-SY5Y细胞的生长速度,加重细胞老化状态。[结论]（1）激活CREB的磷酸化可上调γ分泌酶复合体中PEN2与PS1-CTF的表达,降低APP水平,加快细胞增殖,缓解细胞老化,可设计基于CREB的AD防治策略。（2）过表达Gαq可上调CREB的磷酸化水平,调控的分子机制值得深入研究。

关键词： β淀粉样蛋白 γ分泌酶早老素1 早老素增强子2 环磷酸蛋白反应元件结合蛋白

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反常性痤疮PSENEN基因突变患者信号通路改变研究

反常性痤疮PSENEN基因突变患者信号通路改变研究

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作者：周鹏军福建医科大学

学位级别：硕士

背景:反常性痤疮(Acne Inversa,AI)是毛囊-皮脂腺-顶泌汗腺单元的慢性炎症性皮肤病,主要累及皱褶部位,皮损可表现为脓肿、窦道、瘢痕形成,严重影响患者的生活质量。2010年,王宝玺教授等首先发现γ-分泌酶的基因突变与反常性痤疮的发病有... 详细信息

背景:反常性痤疮(Acne Inversa,AI)是毛囊-皮脂腺-顶泌汗腺单元的慢性炎症性皮肤病,主要累及皱褶部位,皮损可表现为脓肿、窦道、瘢痕形成,严重影响患者的生活质量。2010年,王宝玺教授等首先发现γ-分泌酶的基因突变与反常性痤疮的发病有关,随后在不同国家证实。γ分泌酶是家族性AI研究的热点,其包含四个组分,分别为:早老素(presenilin,PS)、纳卡斯楚因蛋白(nicastrin,NCT)、前咽缺陷蛋白(anterior pharynx defective-1,APH1)、早老素增强子(presenilin enhancer-2,PEN2)。PEN2蛋白是PSENEN基因翻译的产物,多种疾病可存在PSENEN基因突变,如反常性痤疮、屈侧网状色素沉着症(Dowling-Degos disease,DDD)、家族性粉刺、阿尔兹海默症等,但PSENEN基因在皮肤病的作用至今仍不清楚。目的:本课题旨在研究PSENEN敲减对角质形成细胞γ-分泌酶的影响和相关信号传导通路的改变,以及对角质形成细胞生物学如增殖、分化、凋亡的影响。同时,探讨反常性痤疮PSENEN基因突变的发病机制和治疗靶点,试图寻找有别与阿尔兹海默的独特分子机制。方法:1.设计3条特异性敲减PSENEN的siRNA序列,将培养的人永生角质形成细胞系(HaCaT细胞)分为实验组(PSENEN-siRNA)、阴性对照组(m-siRNA)、空白对照组(加等量转染试剂),用荧光定量PCR和蛋白免疫印迹验证干扰效率,构建HaCaT细胞PSENEN敲减模型;2.全转录组测序检测HaCaT细胞PSENEN敲减后mRNA的表达差异,利用GO分析和KEGG分析解析PSENE对细胞的影响;3.实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹验证差异信号传导通路、对γ-分泌酶功能的影响,同时检测对增殖、分化相关蛋白的影响;在细胞行为学改变方面,利用CCK-8检测细胞增殖,流式检测细胞凋亡。4.收集6例PSENEN基因突变的反常性痤疮患者和6例正常对照皮肤,免疫组化验证mTOR信号通路的改变。结果:1.沉默HaCaT细胞PSENEN 72h PSENEN及PEN2蛋白水平表达均明显下调(p素、m-TOR、代谢信号通路表达下降。代谢通路中糖类、脂类、氨基酸代谢信号通路均下降,并以糖代谢下降为主。3.转染72h内,组间Ki67mRNA及蛋白水平不变,CCK-8和细胞凋亡组间差异无统计学意义。EGFR mRNA及蛋白水平表达均升高(p<0.05),但PI3K-AKTmTOR信号通路相关蛋白差异无统计学意义。4.与正常对照相比,6例PSENEN基因突变患者中,mTOR表达均明显增加,mTOR高表达于表皮、毛囊漏斗部、附属器、炎症细胞。结论:***细胞PSENEN敲减,PEN2蛋白表达下降,引起γ-分泌酶NCT成熟障碍和PS1磷酸化障碍。PSENEN敲减引起HaCaT细胞EGFR信号通路升高。***基因突变患者mTOR在皮损广泛高表达,其信号通路的激活在AI发病中可能存在关联性,未来可能有望成为治疗的新靶点。

关键词： γ-分泌酶早老素增强子2 反常性痤疮 mTOR信号通路 EGFR信号通路全基因组测序

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