检索结果-南通市图书馆

作者：张亭江南大学

学位级别：硕士

目的:通过建立雄性大鼠早期生殖细胞体外培养实验,用相关基因及染色体变化来观察精子发生过程中细胞的分化规律,并为精子体外发生研究奠定理论基础。方法:(1)取出生5天的雄性大鼠睾丸组织,处理成细胞状态后进行体外培养,观察不同时间段... 详细信息

目的:通过建立雄性大鼠早期生殖细胞体外培养实验,用相关基因及染色体变化来观察精子发生过程中细胞的分化规律,并为精子体外发生研究奠定理论基础。方法:(1)取出生5天的雄性大鼠睾丸组织,处理成细胞状态后进行体外培养,观察不同时间段细胞增殖、分化过程。(2)用免疫荧光技术检测基因:DDX4、KI67、PLZF检测细胞分化阶段及生长状态;检测基因:STRA8、KIT、DMC1、SCP3、γH2AX和染色体不同时期形态,检测培养的细胞是否有减数分裂发生,并分析基因的变化趋势及染色体变化趋势;检测基因:AFAF,GATA4,分析是否有圆形精子细胞生成及状态。(3)用qRT-PCR技术检测减数分裂时期标记基因:STRA8、DMC1、KIT、SCP3;单倍体精子形成时期的标记基因:ACROSIN。(4)通过用流式细胞分选技术检测体外分化产生的单倍体细胞。(5)用精子顶体PNA染色检测诱导产生的单倍体精子细胞顶体结构的完整性。结果:(1)细胞在体外培养从第3天开始一直到20天,均有明显的增殖及形态变化。(2)检测培养3天的细胞中DDX4、KI67、PLZF免疫荧光强表达,提示细胞处于精原干细胞的阶段,并且增殖和生长状态良好;检测培养5-10天的细胞KIT、STRA8、DMC1、SCP3、γH2AX荧光强表达,提示细胞处于减数分裂状态;染色体与SCP3、γH2AX的变化一致提示减数分裂关键事件:“联会”、“染色体互换重组”的发生;检测培养20天的细胞中AFAF、GATA4荧光表达提示产生了圆形精子细胞,并且细胞处于良好的生长微环境。(3)qRT-PCR检测0-20天的细胞显示STRA8、DMC1、KIT、SCP3均在第5天开始显著增多,第10天达到顶峰,之后逐渐减少,ACROSIN在第15天显著增多,提示细胞在第5天开始进入减数分裂,第15天有大量的单倍体精子细胞形成。(4)单倍体筛选发现在培养第12天出现单倍体细胞,第20天达到顶峰。(5)培养20天的单倍体细胞PNA染色具有正常的精子细胞的顶体结构。结论:(1)首次将雄性大鼠早期生殖细胞在体外用细胞培养法,培养出具有正常精子顶体结构的圆形单倍体精子样细胞,并描述了细胞增殖分化过程及减数分裂事件。(2)细胞培养法体外诱导产生的单倍体圆形精子样细胞的时间较短,效率较高。

关键词：精子发生减数分裂早期生殖细胞细胞培养法体外培养

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m6A在果蝇早期生殖细胞分化中的功能与机制

m6A在果蝇早期生殖细胞分化中的功能与机制

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作者：谈烨明曲阜师范大学

学位级别：硕士

mA(N6-methyladenosine)是真核生物messager RNA(mRNA)和long non-coding RNA(lncRNA)最为普遍的修饰。早在上个世纪七十年代,mA修饰就已经被发现。而它的生物学意义并不清楚。过去曾一度认为mA修饰是不可被逆转的,以致没有得到足够的... 详细信息

mA(N6-methyladenosine)是真核生物messager RNA(mRNA)和long non-coding RNA(lncRNA)最为普遍的修饰。早在上个世纪七十年代,mA修饰就已经被发现。而它的生物学意义并不清楚。过去曾一度认为mA修饰是不可被逆转的,以致没有得到足够的重视。随着去甲基转移酶FTO(fat mass and obesity-associated protein)的发现,以及高通量测序等先进的技术的应用后,又掀起了mA的研究热。近些年来,对mA的生理功能方面取得了重要的研究成果,然而,mA表观修饰如何影响生物个体的生殖细胞分化过程并不清楚。本研究利用经典模式生物果蝇作为模型,深入探索mA调控果蝇早期生殖细胞分化的机制,揭示其分子基础,对于整个表观遗传研究领域和不孕不育等相关疾病发病机的理论研究具有重大意义。我们利用Me-RIP技术对果蝇卵巢细胞中的mA进行了测序分析,得到了与生殖发育密切相关的mRNA上的mA信息。总共检测到了4442个mA peak位点。mA peak在5’UTR和3’UTR均有富集。与已报道的体外细胞中mA的分布相比,果蝇生殖细胞中的mA在5’UTR的富集程度更高。这提示,果蝇卵巢细胞中的mRNA上的mA修饰可能参与转录和翻译调节。聚类分析则显示,mRNA上的mA在卵子发生、卵巢滤泡细胞发育等生殖过程中显著富集。对测序数据进一步分析发现,vasa、sxl(sex leathal)、orb(oo18 RNA-binding protein)、nanos、oskar、pumilio等与早期生殖发育密切相关的基因mRNA上均有mA修饰。其中sxl的mA修饰已有报道,也佐证了此次mA测序的可靠性。通过MeRIP-qPCR,我们先确定了卵巢中vasa、sxl、orb、bam四个基因的mRNA存在mA修饰,其中orb的mA富集比例较高,可能有较高的mA修饰比例。应用CRISPR/Cas9系统构建的mA甲基转移酶复合物组分ime4、dMETTL14突变体果蝇。其中,得到了ime4插入突变体,dMETTL14缺失突变体。二者发生的突变均发生在第二个外显子中。ime4和dMETTL14两种基因的纯合突变体果蝇羽化后存活时间较短,无法建立稳定系产生后代。育性统计发现,ime4突变体果蝇生育能力减弱。16.67%的ime-/-突变雌性果蝇无法产生后代,dMETTL14突变体果蝇也有类似情况。免疫荧光观察发现,ime-/-突变体果蝇卵巢germarium形态异常,spectrosome数量增多,CB等早期生殖细胞分化异常,滤泡细胞不能正常包裹Cyst。但未观察到dMETTL14-/-突变体果蝇有相应的表型。荧光定量PCR显示,在ime-/-纯合突变果蝇中,vasa和bam的mRNA水平降低,sxl的变化不大,而orb的mRNA提高了30%。以此为基础,进一步分析并确认突变体表型发现,与杂合突变体相比,纯合突变体中Orb蛋白在早期生殖细胞发育谱系中提前表达。故我们得到以下结论:(1)通过果蝇卵巢mA甲基化修饰Me-RIP测序,筛选到了orb等与早期生殖细胞分化密切相关的基因mRNA上的mA位点;(2)mA甲基转移酶纯合突变体果蝇育性下降;(3)甲基转移酶纯合突变体果蝇卵巢早期生殖细胞分化出现异常;(4)纯合突变体果蝇中orb mRNA表达量升高,与之相对应的,Orb蛋白在早期生殖细胞发育谱系中提前表达。总之,本实验表明了,mRNA mA修饰与果蝇早期生殖细胞的分化密切相关。这将有助于我们揭示mRNA上的mA的在体生物学功能,亦可为生殖相关疾病的诊断和治疗提供线索。

关键词：果蝇 m6A 早期生殖细胞分化功能机制

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镉暴露对斑马鱼早期生殖细胞毒性效应的分子机制

镉暴露对斑马鱼早期生殖细胞毒性效应的分子机制

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作者：刘惠芳山西大学

学位级别：硕士

生殖细胞的发生是生物体发育和遗传的基础。胚胎发育过程中,最早出现的生殖细胞称为原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)。研究表明PGCs的形成是生殖细胞发生的关键步骤,在物种延续和进化中基因组信息方面发挥着重要作用。保守的... 详细信息

生殖细胞的发生是生物体发育和遗传的基础。胚胎发育过程中,最早出现的生殖细胞称为原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)。研究表明PGCs的形成是生殖细胞发生的关键步骤,在物种延续和进化中基因组信息方面发挥着重要作用。保守的母源因子如vasa、nanos、piwi、dazl等生殖调控基因决定PGCs的形成、迁移、增殖以及分化过程,在生殖发育中发挥关键作用。因此,对vasa、nanos、piwi、dazl等进行研究,探知早期生殖细胞在个体发育中的变化。镉是一种具有极强毒性的水体重金属污染物,镉暴露对生殖系统造成严重损伤。研究表明,镉暴露导致鱼类性腺功能受损,生殖能力受到破坏,胚胎畸形发育。然而,镉暴露对早期生殖细胞的毒性效应及其机制仍不清楚。因此,本论文以模式生物斑马鱼(Danio rerio)为研究对象,设置四个镉浓度组(0.0μmol/L、8.9μmol/L、17.8μmol/L、35.6μmol/L)对胚胎进行镉暴露,探究镉暴露对斑马鱼早期生殖细胞毒性效应的分子途径。通过观察镉暴露后斑马鱼胚胎中早期生殖细胞数量的变化,确定了镉对早期生殖细胞的迁移和数量造成了严重的影响;通过实时荧光定量PCR检测了镉暴露后不同发育阶段斑马鱼中生殖调控基因vasa、nanos、piwi、dazl表达量的变化;进一步,利用地高辛标记的探针追踪了镉对生殖调控基因表达和定位的影响。研究表明,镉抑制了vasa基因的表达和定位,并影响了与vasa作用相关的分子nanos和piwi的表达和定位,引起PGCs数量减少,PGCs聚集和迁移受阻。推测镉暴露破坏了关键生殖调控基因的功能,进而影响了早期生殖细胞的数量和迁移。本文为镉暴露对鱼类生殖毒性及其作用机制的研究提供了理论依据,在水产养殖中具有潜在的应用价值。研究结果如下:1.镉暴露后斑马鱼胚胎早期生殖细胞迁移的变化本实验设置了四个镉浓度组(0.0μmol/L、8.9μmol/L、17.8μmol/L、35.6μmol/L)对Tg1(kop:EGFP-UTR-nanos3)转基因斑马鱼胚胎进行镉暴露,观察了镉暴露后发育至24 hpf、72 hpf、7 dpf的斑马鱼胚胎中早期生殖细胞的变化。结果显示,与对照组相比,随着镉浓度的升高,发育至不同阶段的斑马鱼中早期生殖细胞的数量均逐渐减少,生殖细胞呈分散状态,出现迁移滞后的现象。2.镉暴露对不同发育阶段的斑马鱼vasa基因表达和分布的影响qPCR检测了镉暴露后不同发育阶段斑马鱼中vasa基因表达量的变化,结果显示,不同浓度镉暴露后,72 hpf、7 dpf幼鱼的vasa表达量与对照组相比均极显著下降(P生殖细胞在细胞内迁移和数量的变化。结果表明,与对照组相比,随着镉浓度的升高,vasa杂交信号逐渐降低,在35.6μmol/L的镉浓度下vasa杂交信号最弱,与定量结果结果一致,且镉暴露后,vasa标记的早期生殖细胞数量急剧减少,且细胞无法聚集、迁移滞后。3.镉暴露对vasa作用途径相关基因表达和分布的影响qPCR检测了镉暴露后斑马鱼胚胎中nanos、piwi和dazl基因表达量的变化,结果显示:与对照组相比,镉暴露后发育至不同阶段的胚胎中nanos、piwi、dazl基因的表达量均显著下降;nanos、piwi、dazl基因在镉浓度为17.8μmol/L、35.6μmol/L时表达量均极显著性降低(P生殖细胞迁移发生滞后且细胞分散无法正确迁移到性腺原基,当镉浓度高于35.6μmol/L时对PGCs的影响最为严重。综上所述得出以下结论:(1)镉暴露导致斑马鱼早期生殖细胞数量显著减少,生殖细胞无法聚集且迁移发生滞后,从而影响性腺形成。特别是发育至7 dpf的幼鱼,其早期生殖细胞的迁移和数量受镉影响最为显著。(2)镉抑制了在斑马鱼胚胎发育过程中起决定性作用的生殖调控基因vasa、nanos、piwi、dazl的表达。(3)镉破坏了关键生殖调控基因的表达和定位,影响了生殖调控基因的功能,导致PGCs数量显著减少,造成PGCs无法迁移到性腺原基。

关键词：斑马鱼早期生殖细胞生殖调控基因生殖毒性镉

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胚胎干细胞起源与本质的探讨

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遗传 2006年第8期28卷 1037-1042页

作者：杨炜峰华进联于海生窦忠英西北农林科技大学陕西省干细胞工程技术研究中心杨凌712100

胚胎干细胞(ESC)建系取材包括桑椹胚的卵裂球、囊胚的内细胞团(ICM)、上胚层细胞和原始生殖细胞(PGCs),甚至从新生鼠睾丸细胞也分离得到ES样细胞。传统观念常常把ESC等同于ICM细胞,也有学者认为ESC更像上胚层细胞,而在已知的基因标记方... 详细信息

胚胎干细胞(ESC)建系取材包括桑椹胚的卵裂球、囊胚的内细胞团(ICM)、上胚层细胞和原始生殖细胞(PGCs),甚至从新生鼠睾丸细胞也分离得到ES样细胞。传统观念常常把ESC等同于ICM细胞,也有学者认为ESC更像上胚层细胞,而在已知的基因标记方面,ESC所具有的特征更接近体内早期生殖细胞。不清楚ESC最接近的体内细胞类型与本质,可能是制约许多品系小鼠和大多哺乳类动物建系成功率提高的原因之一。综述了胚胎多能性细胞、早期生殖细胞和ESC的研究进展及相互关系,发现ESC可源于多种细胞类型。目前仍难以确定ESC最接近的体内细胞类型,进一步应通过研究不同体内细胞类型源ESC系间的差异,以弄清ESC本质,为提高ESC建系效率提供理论支持。

关键词：胚胎干细胞胚胎生殖细胞胚胎多能性细胞早期生殖细胞

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