镉暴露对斑马鱼早期生殖细胞毒性效应的分子机制
作者单位：山西大学
学位级别：硕士
导师姓名：孙敏;王兰
授予年度：2021年
学科分类：07[理学] 09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 0713[理学-生态学]
摘 要：生殖细胞的发生是生物体发育和遗传的基础。胚胎发育过程中,最早出现的生殖细胞称为原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)。研究表明PGCs的形成是生殖细胞发生的关键步骤,在物种延续和进化中基因组信息方面发挥着重要作用。保守的母源因子如vasa、nanos、piwi、dazl等生殖调控基因决定PGCs的形成、迁移、增殖以及分化过程,在生殖发育中发挥关键作用。因此,对vasa、nanos、piwi、dazl等进行研究,探知早期生殖细胞在个体发育中的变化。镉是一种具有极强毒性的水体重金属污染物,镉暴露对生殖系统造成严重损伤。研究表明,镉暴露导致鱼类性腺功能受损,生殖能力受到破坏,胚胎畸形发育。然而,镉暴露对早期生殖细胞的毒性效应及其机制仍不清楚。因此,本论文以模式生物斑马鱼(Danio rerio)为研究对象,设置四个镉浓度组(0.0μmol/L、8.9μmol/L、17.8μmol/L、35.6μmol/L)对胚胎进行镉暴露,探究镉暴露对斑马鱼早期生殖细胞毒性效应的分子途径。通过观察镉暴露后斑马鱼胚胎中早期生殖细胞数量的变化,确定了镉对早期生殖细胞的迁移和数量造成了严重的影响;通过实时荧光定量PCR检测了镉暴露后不同发育阶段斑马鱼中生殖调控基因vasa、nanos、piwi、dazl表达量的变化;进一步,利用地高辛标记的探针追踪了镉对生殖调控基因表达和定位的影响。研究表明,镉抑制了vasa基因的表达和定位,并影响了与vasa作用相关的分子nanos和piwi的表达和定位,引起PGCs数量减少,PGCs聚集和迁移受阻。推测镉暴露破坏了关键生殖调控基因的功能,进而影响了早期生殖细胞的数量和迁移。本文为镉暴露对鱼类生殖毒性及其作用机制的研究提供了理论依据,在水产养殖中具有潜在的应用价值。研究结果如下:1.镉暴露后斑马鱼胚胎早期生殖细胞迁移的变化本实验设置了四个镉浓度组(0.0μmol/L、8.9μmol/L、17.8μmol/L、35.6μmol/L)对Tg1(kop:EGFP-UTR-nanos3)转基因斑马鱼胚胎进行镉暴露,观察了镉暴露后发育至24 hpf、72 hpf、7 dpf的斑马鱼胚胎中早期生殖细胞的变化。结果显示,与对照组相比,随着镉浓度的升高,发育至不同阶段的斑马鱼中早期生殖细胞的数量均逐渐减少,生殖细胞呈分散状态,出现迁移滞后的现象。2.镉暴露对不同发育阶段的斑马鱼vasa基因表达和分布的影响qPCR检测了镉暴露后不同发育阶段斑马鱼中vasa基因表达量的变化,结果显示,不同浓度镉暴露后,72 hpf、7 dpf幼鱼的vasa表达量与对照组相比均极显著下降(P0.01)。N-乙酰半胱氨酸(NAC)和镉共同处理组与单独镉处理组相比,vasa表达量上升,在35.6μmol/L+NAC处理组下vasa表达量显著升高。进一步通过整胚原位杂交检测了镉暴露后vasa标记的生殖细胞在细胞内迁移和数量的变化。结果表明,与对照组相比,随着镉浓度的升高,vasa杂交信号逐渐降低,在35.6μmol/L的镉浓度下vasa杂交信号最弱,与定量结果结果一致,且镉暴露后,vasa标记的早期生殖细胞数量急剧减少,且细胞无法聚集、迁移滞后。3.镉暴露对vasa作用途径相关基因表达和分布的影响qPCR检测了镉暴露后斑马鱼胚胎中nanos、piwi和dazl基因表达量的变化,结果显示:与对照组相比,镉暴露后发育至不同阶段的胚胎中nanos、piwi、dazl基因的表达量均显著下降;nanos、piwi、dazl基因在镉浓度为17.8μmol/L、35.6μmol/L时表达量均极显著性降低(P0.01)。而镉和NAC共同处理组与单独镉处理组相比,基因表达量升高。24 hpf胚胎nanos与7 dpf胚胎piwi基因的原位杂交结果显示:随着镉浓度的升高nanos和piwi杂交信号逐渐降低,nanos和piwi标记的生殖细胞迁移发生滞后且细胞分散无法正确迁移到性腺原基,当镉浓度高于35.6μmol/L时对PGCs的影响最为严重。综上所述得出以下结论:(1)镉暴露导致斑马鱼早期生殖细胞数量显著减少,生殖细胞无法聚集且迁移发生滞后,从而影响性腺形成。特别是发育至7 dpf的幼鱼,其早期生殖细胞的迁移和数量受镉影响最为显著。(2)镉抑制了在斑马鱼胚胎发育过程中起决定性作用的生殖调控基因vasa、nanos、piwi、dazl的表达。(3)镉破坏了关键生殖调控基因的表达和定位,影响了生殖调控基因的功能,导致PGCs数量显著减少,造成PGCs无法迁移到性腺原基。
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