检索结果-南通市图书馆

作者：方倪冉华南农业大学

学位级别：硕士

无血清全悬浮MDCK细胞培养H9亚型禽流感病毒是旨在克服鸡胚及贴壁细胞在禽流感疫苗生产中的缺陷而建立的一种培养方式,然而目前无血清全MDCK细胞培养H9亚型禽流感病毒工艺尚未成熟,因此本文对培养H9亚型禽流感病毒的工艺进行探究,为建... 详细信息

无血清全悬浮MDCK细胞培养H9亚型禽流感病毒是旨在克服鸡胚及贴壁细胞在禽流感疫苗生产中的缺陷而建立的一种培养方式,然而目前无血清全MDCK细胞培养H9亚型禽流感病毒工艺尚未成熟,因此本文对培养H9亚型禽流感病毒的工艺进行探究,为建立和优化细胞生物反应器大规模生产禽流感疫苗工艺提供试验数据支持和借鉴。本研究首先在摇瓶中探究MDCK-sus细胞无血清全悬浮培养生长特性,感染参数对病毒增殖的影响,AIV在MDCK-sus细胞增殖过程中营养物质代谢变化,补加不同比例新鲜培养基接种病毒后对不同时间活细胞密度及病毒增殖的影响。结果表明:以1.5×10cells/m L的接种密度培养细胞具有最优的效率;采用终浓度为7μg/m L的TPCK-胰酶、培养温度为33℃、MOI为0.01、TOI为60小时较为适宜,优化后禽流感病毒HA滴度值可达到10 log,病毒含量达到10EID/0.1 m L;禽流感病毒在细胞增殖过程中加快了葡萄糖和谷氨酰胺等营养物质的消耗,同时也加快了对乳酸和铵离子等代谢产物的生成;各比例组补加新鲜培养基并接种病毒后,按照3:2的细胞悬液与新鲜培养基的体积比补加新鲜培养基为最优。进一步尝试了不同规格的生物反应器的工艺,通过放大培养至3 L搅拌式生物反应器进行验证及探究p H值对AIV增殖的影响,继续放大培养至50 L激流式生物反应器进行验证。结果表明:当p H值为7.0时,感染后48小时AIV的HA滴度达到峰值11 log,病毒含量达到峰值10EID/0.1 m L;基于3 L搅拌式生物反应器的悬浮细胞及病毒培养工艺,继续放大培养至50 L生物反应器:感染后48小时HA滴度达到峰值11 log,病毒含量达到最高值10EID/0.1 m L,与3 L生物反应器培养特性基本一致。为了增加MDCK细胞表面受体丰度从而进一步提高禽流感病毒的滴度,本研究将鸡ST3GAL1基因插入到慢病毒载体中构建重组慢病毒,然后转导细胞,经嘌呤霉素筛选后,收集抗性细胞并命名为MDCK-adh-st3gal1细胞;MDCK-adh-st3gal1细胞传代培养至第10代,经q PCR法检测细胞鸡ST3GAL1基因的表达及流式细胞术检测细胞表面SAa-2,3Gal和SAa-2,6Ga受体丰度,最后对比改造前后的细胞对H9亚型禽流感病毒增殖能力。结果表明:重组质粒转导细胞后,效果良好,荧光率达80%以上;MDCK-adh-st3gal1细胞传至第10代,目的基因鸡ST3GAL1仍有表达;稳定表达鸡ST3GALI基因的MDCK细胞,提高了细胞表面a-2,3连接型受体丰度,更适于H9亚型禽流感病毒的感染。本课题研究了生物反应器无血清全悬浮MDCK细胞培养H9亚型禽流感病毒的生产工艺及通过改造MDCK细胞系,为细胞生物反应器大规模生产禽流感疫苗工艺的建立和优化提供了参考和借鉴意义。

关键词： H9亚型禽流感病毒 MDCK细胞无血清全悬浮培养鸡ST3GAL1基因

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

不同MDCK单克隆细胞株对H5亚型禽流感病毒增殖条件和放大工艺的研究

引用

动物医学进展 2020年第4期41卷 38-41页

作者：方琳朱辉黄皓源彭思力覃海康梁昭平广州市华南农大生物药品有限公司广东广州511300

为了解H5亚型禽流感病毒rFJ56株在MDCK全悬浮细胞上的增殖规律,确定100 L生物反应器工艺的最适接毒量和收获时间,对H5亚型禽流感病毒rFJ56株敏感的MDCK全悬浮细胞进行单克隆筛选和全悬浮驯化,筛选出对该毒株最敏感的MDCK单克隆细胞株;... 详细信息

为了解H5亚型禽流感病毒rFJ56株在MDCK全悬浮细胞上的增殖规律,确定100 L生物反应器工艺的最适接毒量和收获时间,对H5亚型禽流感病毒rFJ56株敏感的MDCK全悬浮细胞进行单克隆筛选和全悬浮驯化,筛选出对该毒株最敏感的MDCK单克隆细胞株;在摇瓶工艺的基础上,将该细胞在100 L生物反应器中接种H5亚型禽流感病毒rFJ56株,检测接种后不同时间病毒HA效价和病毒滴度(EID 50),确定最适接毒量和收获时间。共筛选出22株MDCK全悬浮细胞单克隆细胞株,其中5株对H5亚型禽流感病毒rFJ56株最敏感,接种后病毒HA效价均可达到9 log2;对MDCK单克隆细胞株按0.01%体积比接种H5亚型禽流感病毒rFJ56株,在100 L生物反应器中培养60 h,HA效价可达10 log2,病毒含量可达108.17 EID 50/0.1 mL,可为H5亚型禽流感病毒无血清全悬浮培养放大工艺提供参考。

关键词： H5亚型禽流感病毒 MDCK单克隆细胞株无血清全悬浮培养接毒量收获时间

来源：

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

F81单克隆细胞株无血清悬浮驯化后用于繁殖猫泛白细胞减少症病毒的初步探究

F81单克隆细胞株无血清悬浮驯化后用于繁殖猫泛白细胞减少症病毒...

引用

作者：张久鑫吉林农业大学

学位级别：硕士

猫泛白细胞减少症在世界范围内普遍存在,对宠物、养殖业及野生动物存在重大威胁。此病具有极高的感染率和致死率,且预后效果较差,接种疫苗被认为是最有效的防控手段。在疫苗制备过程中,抗原的制备是重要的环节,直接影响着疫苗的质量。... 详细信息

猫泛白细胞减少症在世界范围内普遍存在,对宠物、养殖业及野生动物存在重大威胁。此病具有极高的感染率和致死率,且预后效果较差,接种疫苗被认为是最有效的防控手段。在疫苗制备过程中,抗原的制备是重要的环节,直接影响着疫苗的质量。目前大部分生物制品多采用转瓶培养或微载体培养,产出的病毒效价较低,而且由于血清的使用使得产品成本居高不下,批次间差异大,质量不稳定,且容易产生污染。从行业发展和产品竞争力考虑,应用悬浮培养细胞系,通过对生物反应器培养参数的控制,开展大规模动物病毒培养,有助于降本增效,提高产品品质和企业核心竞争力。本研究从用于生产猫泛白细胞减少症疫苗的猫肾细胞(F81)系出发,采用逐步降血清法、有限稀释法和悬浮驯化等方法得到单克隆低血清悬浮F81细胞系。进而优化血清浓度、培养基、细胞传代密度、摇床转速和冻存条件等培养参数。结果表明,驯化得到的低血清单克隆F81-18细胞株,低血清悬浮细胞培养血清浓度为2%,最佳传代密度为1×10cells/m L,细胞培养72 h后达到最大密度5.83×10 cells/m L,此时细胞活率为92%。无血清单克隆株F81-09最佳培养条件为,使用无血清培养基M-03-01、细胞传代密度1.0×10cells/mL、摇床转速120 r/min、培养温度37℃。此培养条件下无血清单克隆株F81-09,细胞培养96 h后达到最大生长密度8.63×10 cells/m L,细胞活率为90%。细胞最佳冻存条件为冻存密度为1.5×10 cells/m L,冻存液组成成分为无血清培养基、胎牛血清和DMSO,相应比例为6:3:1。对猫泛白细胞减少症病毒悬浮培养关键技术参数开展优化分析,筛选细胞接种密度、MOI、培养温度等参数,进而根据病毒滴度变化确定培养条件及收毒时间。利用控制变量法筛选出适合无血清单克隆株F81-09培养猫泛白细胞减少症病毒的培养参数。结果表明,猫泛白细胞减少症病毒最佳培养工艺为,采用同步接毒法,接毒时细胞密度为1.0×10cells/m L,MOI为3.5×10,摇床转速为120 r/min、在37℃条件下培养。接毒后培养72h,培养得到的猫泛白细胞减少症病毒病毒滴度最大可达到10TCID/0.1mL,制备抗原生产疫苗,动物免疫后28 d,HI≥1∶1024。在15 L生物反应器中对培养参数p H、溶氧浓度、搅拌速度、温度进行筛选。结果表明生物反应器培养无血清单克隆株F81-09最佳培养条件为p H=7.1、溶氧浓度为50%、搅拌速度为80 rpm、温度为37℃。综上所述,本研究建立的无血清悬浮培养F81细胞可在生物反应器中稳定生长,可快速规模化繁殖病毒,且采用无血清培养基,可显著降低生产成本,提高成本效益。本文报道贴壁F81细胞成功适应无血清悬浮培养,达到了降本增效的目的,彰显了其在相关生物制品生产中的巨大潜力。利用优化后的病毒悬浮培养工艺,将所得病毒液制备疫苗对家猫进行免疫,初步评价,结果显示疫苗的免疫原性及安全性良好。为下一步生物反应器规模化生产猫泛白细胞减少症疫苗提供了基础数据,为其他以F81细胞作为细胞基质的生物制品研发提供参考和借鉴。

关键词： F81细胞单克隆悬浮驯化无血清全悬浮培养猫泛白细胞减少症病毒规模化培养

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

一株鸭坦布苏病毒的分离鉴定及其细胞候选株悬浮培养特性的研究

一株鸭坦布苏病毒的分离鉴定及其细胞候选株悬浮培养特性的研究

引用

作者：何敏怡华南农业大学

学位级别：硕士

2010年,我国主要蛋鸭养殖区爆发了由鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)引起的一种以蛋鸭产蛋量下降为主要临床症状,以卵巢炎、病毒性脑炎为主要病理特征的传染病,给养鸭业造成了巨大的经济损失。目前我国培养DTMUV的主要方式为鸡... 详细信息

2010年,我国主要蛋鸭养殖区爆发了由鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)引起的一种以蛋鸭产蛋量下降为主要临床症状,以卵巢炎、病毒性脑炎为主要病理特征的传染病,给养鸭业造成了巨大的经济损失。目前我国培养DTMUV的主要方式为鸡胚或鸭胚以及贴壁细胞培养,存在一定的局限性,为研究该病毒的大规模悬浮培养技术,本研究分离鉴定了一株鸭坦布苏病毒,利用鸭胚胎干细胞衍生细胞株EB66细胞进行无血清全悬浮培养技术的研究,对进一步探索鸭坦布苏病毒培养工艺和疫苗的研制提供一种新思路。2017年12月,从广东省某规模化蛋鸭养殖场采集若干份疑似为鸭坦布苏病毒病的病料,接种9日龄鸭胚3 d后开始死亡,胚体变小,肝脏、脑组织呈现肿大出血症状。收获的尿囊液无血凝性,提取RNA进行RT-PCR鉴定为阳性,常见外源病毒为阴性。该病毒可在DEF细胞上增殖,接种后48 h出现病变,ELD和TCID分别为10/0.2 m L和10/0.2 m L。为获得分离株的全长基因组和遗传进化情况,本研究针对该病毒设计11对引物,最终获得该分离株的全基因序列,大小为10990 bp,并命名为DTMUV QY17株。该毒株与黄病毒属司提阿万病毒同源性最高,同源性达86.9%;与2010年至2016年从鹅源、蚊源、鸡源、麻雀源分离到的19株坦布苏病毒毒株进行同源性分析,同源性为96.2%以上,由此可见鸭坦布苏病毒基因组差异性不大,病毒较稳定。为研究DTMUV QY17株的致病性,选取15只9日龄樱桃谷鸭,每只腿部肌肉攻毒剂量为0.2 m L(含1000 ELD),3天后实验组出现死亡,死亡率为20%。解剖后,可见死亡鸭子脑组织、肝脏、脾脏等多处脏器出血肿大,病理切片显示脑组织为病毒性脑炎、胰腺颗粒性坏死、肝脏和肾脏细胞坏死、淋巴细胞浸润增生等病理变化。通过q PCR检测,显示攻毒3 d时,鸭子肝脏、脾脏、胰腺和脑组织病毒含量最高,5d后各组织器官的病毒含量开始降低。为研究分离株能否在EB66细胞稳定传代,本研究将DTMUV QY17株接种于EB66细胞,盲传至第二十代进行传代驯化,结果显示,ELD可稳定在10/0.2 m L。培养后病毒的NS1和E蛋白基因核苷酸和氨基酸分析显示,同源性均在99.1%以上,只有1个氨基酸发生突变,证明DTMUV QY17株在EB66细胞无血清全悬浮培养中能稳定传代,且病毒滴度随着传代次数增加而提高。为研究EB66细胞无血清全悬浮培养扩增DTMUV QY17株的工艺,首先确定EB66的最佳接种浓度为1.0×10 cells/m L和最佳接种时间(TOI)为60 h,随后分别以不同MOI和不同收获时间无血清全悬浮培养DTMUV QY17株,检测ELD后表明最佳MOI为10,最佳收获时间为72 h。摇瓶中优化后的条件复制于5 L生物反应器,最高的ELD可达10/0.2 m L,高于同条件下摇瓶培养的最高ELD(10/0.2m L),初步实现了扩大培养的工艺尝试。无血清全悬浮培养收获的病毒经过2/1000甲醛灭活24 h,乳化制备灭活疫苗并免疫14日龄樱桃谷鸭。首免14 d后进行二免,商品ELISA试剂盒检测血清结果显示抗体水平低,本研究的疫苗制备以及血清学检测方法有待进一步研究。

关键词：鸭坦布苏病毒分离鉴定无血清全悬浮培养

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

全悬浮MDCK细胞驯化与H9亚型禽流感疫苗毒种制备

引用

广东畜牧兽医科技 2021年第6期46卷 45-49页

作者：赖汉漳谭文松詹烜子刘旭平麦康聪刘玉鹏汤钦盘伟岚王小芬陈华坚陈培军许东蕾陈瑞爱肇庆大华农生物药品有限公司农业部动物疫病防控生物技术与制品创制重点实验室广东省兽用生物制品技术研究与应用企业重点实验室广东肇庆526238 华南农业大学兽医学院广东广州510642 上海倍谙基生物科技有限公司上海200131 华东理工大学生物工程学院上海200237

为了研制悬浮细胞源H9亚型禽流感灭活疫苗,笔者对细胞和疫苗毒种进行了驯化。将贴壁的MDCK细胞利用直接适应无血清法经过方瓶预驯化3代、摇瓶培养驯化13代得到了一株适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系,命名为MDCK(DHN)细胞系。该细胞密... 详细信息

为了研制悬浮细胞源H9亚型禽流感灭活疫苗,笔者对细胞和疫苗毒种进行了驯化。将贴壁的MDCK细胞利用直接适应无血清法经过方瓶预驯化3代、摇瓶培养驯化13代得到了一株适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系,命名为MDCK(DHN)细胞系。该细胞密度高,呈单个分散生长,形态饱满,大小均一,活性强。在此基础上,将H9亚型禽流感CN株鸡胚毒通过悬浮MDCK(DHN)细胞连续传代驯化9代后得到了在细胞中稳定、高效复制的CN株细胞毒,并且该CN株细胞毒与CN株鸡胚毒在抗原性和免疫原性等生物学特性均保持了一致。本研究成功研制了可用于悬浮细胞源H9亚型禽流感灭活疫苗生产的MDCK(DHN)悬浮细胞系和细胞毒种。

关键词： MDCK细胞无血清全悬浮培养禽流感病毒驯化

来源：

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

欢迎您,

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：

通借通还

欢迎您,

建议与咨询 留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

请选择保存的检索档案： 新增检索档案 确定 取消

请选择收藏分类： 新增自定义分类 确定 取消

通借通还

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：