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PD-L1调控巨噬细胞极化在血管损伤后新生内膜形成中的作用机制

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PD-L1调控巨噬细胞极化在血管损伤后新生内膜形成中的作用机制

作者：宋凌红石河子大学

学位级别：硕士

目的:经皮冠状动脉介入治疗(PCI)术后的再狭窄严重了影响患者预后疗效。由巨噬细胞介导的慢性炎症在PCI术后再狭窄中起着至关重要的作用。巨噬细胞可受外界微环境的影响极化为M1、M2两种不同的亚型,在炎症反应中能够发挥不同作用,但其在... 详细信息

目的:经皮冠状动脉介入治疗(PCI)术后的再狭窄严重了影响患者预后疗效。由巨噬细胞介导的慢性炎症在PCI术后再狭窄中起着至关重要的作用。巨噬细胞可受外界微环境的影响极化为M1、M2两种不同的亚型,在炎症反应中能够发挥不同作用,但其在PCI术后再狭窄中发挥的作用及调控机制尚未明确。本研究通过体内外实验结合生物信息学分析探究血管损伤后新生内膜形成中调控巨噬细胞极化的关键分子,旨在为术后再狭窄提供有效的治疗靶点。方法:用HE染色检测假手术组、手术组、DMSO组和BMS-1(PD-L1抑制剂)组血管新生内膜增生情况;应用qRT-PCR方法,测定与巨噬细胞极化相关IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β的mRNA和PD-L1、PI3K、AKT、m-TOR、CD68的mRNA水平;基于GEO数据库利用生物信息学分析调控巨噬细胞极化的关键分子和PD-L1调控信号通路富集分析;Western blot检测靶血管PD-L1和细胞中PD-L1、PI3K、AKT、p-AKT、m-TOR、p-m-TOR蛋白的表达;运用ELISA检测血浆IL-1β、IL-10表达。结果:(1)成功构建了SD大鼠颈动脉球囊损伤模型,并利用HE染色发现了血管损伤后7d、14d、21d、28d、45d新生内膜增生明显;靶血管中IL-1β、TNF-αmRNA在0.5h-14d增加;IL-10和TGF-βmRNA在14d-28d表达增加;运用巨噬细胞极化数据集GSE36537构建PPI网络发现关键分子PD-L1、IL15等;PD-L1蛋白和mRNA在血管损伤后新生内膜形成中14d、21d、28d增加。(2)使用PD-L1抑制剂BMS-1后,新生内膜形成中PD-L1的蛋白和mRNA的表达不同程度的抑制;HE染色发现新生内膜增殖不同程度的减少,IL-1β和TNF-α的mRNA在8h、1d、7d、14d降低;然而,IL-10和TGF-β的mRNA在7d和14d增加,而TGF-β的mRNA表达在3d、14d-45d降低。ELISA实验发现BMS-1组血浆中IL-1β、IL-10呈总体减少趋势。(3)镜下观察体外提取单核细胞至PMA诱导成巨噬细胞的形态变化,CD68的mRNA增加;BMS-1作用的巨噬细胞PD-L1蛋白和mRNA水平的表达显著减少;原代巨噬细胞IL-1β和TNF-α的mRNA增高,IL-10和TGF-β的mRNA降低。对GSE190715进行KEGG分析发现富集于PI3K-AKT信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用等信号通路;发现PD-L1抑制的巨噬细胞中PI3K信号通路分子的蛋白、mRNA表达增高。结论:(1)PD-L1抑制能够调节巨噬细胞极化参与血管损伤后新生内膜的形成过程;(2)PD-L1能够通过PI3K信号通途调控巨噬细胞极化。

关键词：巨噬细胞极化 PD-L1 血管损伤新生内膜形成

PD-L1调控巨噬细胞代谢重编程参与血管损伤后新生内膜形成的初探

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PD-L1调控巨噬细胞代谢重编程参与血管损伤后新生内膜形成的初探

作者：王玉冰石河子大学

学位级别：硕士

目的:经皮冠状动脉介入治疗(PCI)术后再狭窄的发生严重威胁着患者术后健康。炎症反应在血管损伤后迅速发生,并且募集大量巨噬细胞到损伤部位。巨噬细胞在响应外界刺激作用时可以通过不同的代谢,重编程为M1和M2型巨噬细胞,参与疾病进展... 详细信息

目的:经皮冠状动脉介入治疗(PCI)术后再狭窄的发生严重威胁着患者术后健康。炎症反应在血管损伤后迅速发生,并且募集大量巨噬细胞到损伤部位。巨噬细胞在响应外界刺激作用时可以通过不同的代谢,重编程为M1和M2型巨噬细胞,参与疾病进展。因此,对血管损伤后巨噬细胞代谢重编程的清晰了解将有助于治疗和干预PCI术后再狭窄的发生,本研究通过体内外实验初步探索损伤微环境中糖代谢变化水平对巨噬细胞的影响,调控巨噬细胞代谢重编程对血管平滑肌细胞(VSMCs)的影响,旨在为PCI术后再狭窄的治疗提供新的诊疗方向。方法:(1)通过HE染色检测假手术组、手术组新生内膜形成情况;通过葡萄糖氧化酶法、丙酮酸含量测试、乳酸酸含量测试检测外周血中葡萄糖消耗、丙酮酸生成和乳酸生成情况;基于GEO数据库利用生物信息学分析巨噬细胞表达差异;(2)模拟代谢改变微环境培养巨噬细胞,应用q RT-PCR检测巨噬细胞极化相关IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β mRNA水平变化,Western Blot检测巨噬细胞PD-L1蛋白表达;(3)HE染色检测DMSO组和BMS-1(PD-L1抑制剂)组新生内膜形成情况,葡萄糖氧化酶法、丙酮酸含量测试、乳酸酸含量测试检测BMS-1对外周血中代谢物影响;(4)给予BMS-1作用巨噬细胞,CCK8检测巨噬细胞增殖,流式细胞术检测巨噬细胞PD-L1表达及巨噬细胞极化;通过葡萄糖氧化酶法、丙酮酸含量测试、乳酸含量测试检测巨噬细胞内及培养上清液中糖代谢物水平,ATP含量测试检测巨噬细胞内ATP含量变化;qRT-PCR检测巨噬细胞糖酵解相关HK-2、PKM2、PFK的mRNA表达情况;Western Blot检测BMS-1对巨噬细胞HK-2、PKM、PFK蛋白影响;通过ELISA实验检测BMS-1对巨噬细胞分泌细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-10及TGF-β1的影响;(5)获取不同处理巨噬细胞条件培养基用于VSMCs培养,通过CCK-8实验和平板克隆实验检测VSMCs增殖能力;细胞划痕和Transwell检测VSMCs迁移能力;Western Blot检测VSMCs的SMA、Vimentin、OPN蛋白表达,进一步地模拟巨噬细胞代谢后微环境变化进行VSMCs培养,通过平板克隆实验检测VSMCs增殖能力影响;细胞划痕和Transwell检测VSMCs迁移能力。结果:(1)构建颈动脉球囊损伤动物模型,HE染色结果显示血管损伤后7d、14d、21d、28d、45d新生内膜形成明显;血管损伤后1d-45d,外周血中葡萄糖含量减少(P新生内膜增生被抑制,促进体内糖酵解水平;与DMSO组比较,BMS-1刺激后在3d-45d葡萄糖含量减少(P新生内膜形成;(3)抑制PD-L1促进巨噬细胞糖代谢重编程,通过影响VSMCs增殖、迁移及表型转化参与新生内膜生成。

关键词：糖酵解巨噬细胞代谢 PD-L1 血管损伤新生内膜形成

间充质干细胞外泌体对血管损伤后新生内膜形成的影响与机制研究

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间充质干细胞外泌体对血管损伤后新生内膜形成的影响与机制研究

作者：刘指挥西南大学

学位级别：硕士

研究背景与目的:血管内再狭窄是经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention,PCI）术后,血管内皮创伤而再次发生管腔狭窄、阻塞的病理过程。尽管随着药物支架和药物球囊的出现使再狭窄发生率从最初的10%-30%降低至目前... 详细信息

研究背景与目的:血管内再狭窄是经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention,PCI）术后,血管内皮创伤而再次发生管腔狭窄、阻塞的病理过程。尽管随着药物支架和药物球囊的出现使再狭窄发生率从最初的10%-30%降低至目前的5%左右,大大改善了冠心病患者预后,使冠心病的治疗发生里程碑式改变,但再狭窄的防治始终未获得突破性进展,特别是在糖尿病和复杂病变如弥漫病变、小血管、分叉病变等尤为突出,再狭窄率可达20%以上,并且药物洗脱支架或球囊并不能用于治疗所有的新生内膜斑块的形成。因此,解决血管内再狭窄成为刻不容缓的重大课题。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）是一种多能干细胞,他们可以从大量的结缔组织中获得,如:骨髓,脂肪、脐带血等,具有自我更新的特性,可分化为多种类型的细胞,如成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、平滑肌细胞（smooth muscle cells,SMC）等。MSC多能分化及易于扩大培养的特性使得其治疗研究倍受关注。作为细胞之间传递功能物质的桥梁,外泌体在细胞间相互作用的微环境中受到越来越广泛的重视。外泌体作为MSC分泌的膜包裹囊泡,不但优于MSC的特性,而且大大降低了MSC的移植风险,如低存活率、免疫排斥、以及致畸致瘤等,并且具有更稳定、易储存、低免疫原性、低风险的特点。因此间充质干细胞外泌体（exosomes derived from mesenchymal stem cells,MSC-Exo）在修复损伤组织或器官、抑制炎性、免疫调节相关研究方面日益增加。骨髓MSC已显示出通过促进损伤血管的重新内皮化抑制新生内膜的形成,人类MSC也显示可以通过减少炎症反应而具有治疗作用。此外,MSC-Exo能够介导细胞与其靶细胞之间的细胞间通讯,并且通过mi R-125b抑制血管损伤后新生内膜的形成。然而,目前尚未完全阐述MSC-Exo对血管损伤后新内膜形成的作用及确切机制。为了分析MSC-Exo对血管损伤后新生内膜形成的影响及相关机制,本研究过程中,引入MSC-Exo,体外分析MSC-Exo对内皮细胞（endothelial cells,EC）增殖和迁移的影响及相关机制,体内通过构建球囊诱导的大鼠颈动脉损伤模型,了解血管损伤后,外源性注入MSC-Exo是否可以向血管损伤区域定向聚集、靶向归巢,乃至对血管损伤后新生内膜形成产生何种影响及其可能作用机制。研究方法:1.MSC-Exo的分离提取与生物学特征从大鼠骨髓中分离提取MSC,通过显微镜观察和流式细胞术鉴定细胞表面抗原两个方法鉴定培养细胞,利用外泌体纯化试剂盒分离MSC培养上清中外泌体,通过透射电子显微镜（transmission electron microscope,TEM）、纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis,NTA）和蛋白免疫印迹（western blot）方法鉴定提取外泌体的生物学特征,将PKH67标记的外泌体与EC共培养,通过共聚焦电子显微镜检测EC对外泌体的摄取情况。2.MSC-Exo对EC增殖和迁移的影响及相关机制为了检测MSC-Exo对EC增殖的影响,将EC分为对照（Control）组、MSC培养上清（MSC-CM）组、EC培养上清（EC-CM）组、MSC-Exo组和去除MSC-Exo的MSC培养上清（CM-Exo-free）组,通过细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK8）和细胞免疫荧光检测它们对EC增殖的影响,通过将MSC-Exo分别稀释成0μg/m L、0.1μg/m L、1μg/m L、10μg/m L和100μg/m L与EC共培养,CCK8检测对EC增殖的影响。通过western blot检测MSC-Exo对EC增殖相关蛋白:增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）和细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）表达的影响。为了检测MSC-Exo对EC迁移的影响,将EC分为Control组和MSC-Exo组,通过细胞划痕检测MSC-Exo对EC迁移的影响。通过western blot检测MSC-Exo对EC迁移相关蛋白:波形蛋白（Vimentin）、基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase,MMP2）和基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase,MMP9）表达的影响。为了进一步分析Erk1/2信号通路对EC增殖和迁移的影响,将EC分为MSC-Exo组、MSC-Exo+DMSO组和MSC-Exo+SCH772984（Erk1/2抑制剂）组,通过CCK8、细胞免疫荧光和细胞划痕检测它们对EC增殖和迁移的影响,通过western blot检测EC中PCNA、Cyclin D1、MMP2、MMP9、Vimentin

关键词： MSC-Exo 内皮细胞 Erk1/2信号通路新生内膜形成

RSPO3参与新生内膜形成及调节血管平滑肌细胞功能的实验研究

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中国心血管病研究 2022年第7期20卷 637-642页

作者：渠航陈冲罗雪阳丁晓维上海交通大学医学院附属新华医院心血管发育与再生医学研究所上海市200082

目的探究RSPO3是否参与小鼠血管损伤后新生内膜形成以及对平滑肌细胞功能的调控作用。方法本实验于2021年5月至2022年2月在新华医院发育与再生医学研究所完成。构建小鼠股动脉导丝损伤模型,检测股动脉RSPO3的表达;在血小板衍生生长因子-... 详细信息

目的探究RSPO3是否参与小鼠血管损伤后新生内膜形成以及对平滑肌细胞功能的调控作用。方法本实验于2021年5月至2022年2月在新华医院发育与再生医学研究所完成。构建小鼠股动脉导丝损伤模型,检测股动脉RSPO3的表达;在血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)诱导人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)增殖及迁移的细胞模型中检测RSPO3的表达,观察小干扰RNA敲低RSPO3后PDGF-BB对HASMCs作用的变化。结果小鼠股动脉损伤后RSPO3表达升高,且主要集中表达在新生内膜区域;PDGF-BB处理HASMCs后RSPO3时间依赖性表达升高,敲低RSPO3抑制PDGF-BB诱导的HASMCs增殖和迁移。结论RSPO3参与小鼠新生内膜形成的过程,促进PDGF-BB诱导的HASMCs增殖及迁移。

关键词： RSPO3 新生内膜形成 PDGF-BB 血管平滑肌细胞

降钙素基因相关肽对颈动脉球囊介入损伤后大鼠新生内膜形成的影响

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中国老年学杂志 2016年第9期36卷 2082-2086页

作者：王荣勤曾宪强马彦高南阳市中心医院介入科河南南阳473009

目的探讨降钙素基因相关肽(CGRP)对颈动脉球囊介入损伤后大鼠新生内膜形成的影响。方法采用雄性SD大鼠建立颈总动脉球囊损伤模型,将60只模型大鼠随机分为对照组,低剂量CGRP(CGRP-L)组和高剂量CGRP(CGRP-H)组。CGRP-L组和CGRP-H组于球囊... 详细信息

目的探讨降钙素基因相关肽(CGRP)对颈动脉球囊介入损伤后大鼠新生内膜形成的影响。方法采用雄性SD大鼠建立颈总动脉球囊损伤模型,将60只模型大鼠随机分为对照组,低剂量CGRP(CGRP-L)组和高剂量CGRP(CGRP-H)组。CGRP-L组和CGRP-H组于球囊损伤后每天腹腔注射50、100μg/kg CGRP,而对照组于球囊损伤后每天腹腔注射等体积生理盐水。采用流式细胞术检测内皮祖细胞(EPC)动员情况,酶联免疫吸附法检测外周血中促血管修复因子〔血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、基质细胞衍生因子(SDF)-1和碱性成纤维因子(b FGF〕及血清内皮素(ET)-1水平,分光光度法检测血清一氧化氮(NO)水平,HE染色观察颈动脉在球囊损伤后的形态学变化及内膜增生情况。结果CGRP-L组和CGRP-H组外周血中CD34和VEGF受体共同标记的EPC动员比例分别为(15.26±2.70)%和(23.55±3.92)%,均高于对照组的(7.12±1.14)%(P内膜面积、中膜面积及两者比值均降低(P新生内膜形成,可通过促进EPC动员及升高外周血促血管修复因子辅助内皮损伤修复。

关键词：降钙素基因相关肽颈动脉球囊介入损伤新生内膜形成

血小板衍生生长因子BB激活细胞外信号调节激酶1/2参与血管新生内膜形成

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中华高血压杂志 2016年第12期24卷 1147-1153页

作者：陈静李晓东洪墨纳高平进上海交通大学医学院附属瑞金医院北院高血压科上海201801 上海交通大学医学院附属瑞金医院高血压科上海市高血压研究所

目的血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)是介导血管新生内膜形成最重要的生长因子之一,本研究探讨PDGF-BB激活细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)参与血管新生内膜的形成。方法在整体实验上,将24只250g健康雄性SD大鼠分为3组:A组为假手术组;B组... 详细信息

目的血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)是介导血管新生内膜形成最重要的生长因子之一,本研究探讨PDGF-BB激活细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)参与血管新生内膜的形成。方法在整体实验上,将24只250g健康雄性SD大鼠分为3组:A组为假手术组;B组为颈动脉球囊损伤组;C组为颈动脉球囊损伤干预组(ERK1/2抑制剂PD98059)。建立颈动脉球囊损伤模型后,经血管外膜途径局部给予PD98059抑制ERK1/2激活,苏木精-伊红(HE)染色分析损伤血管形态学变化,免疫荧光检测巨噬细胞浸润。原代培养外膜成纤维细胞,Western blot检测细胞ERK1/2的激活,划痕实验观察细胞迁移变化。结果损伤组新生内膜面积和内膜中膜比大于干预组[(0.149±0.012)比(0.077±0.021)mm2,1.137±0.088比0.682±0.141,均P新生内膜形成,伴随巨噬细胞浸润明显减少。20μg/L PDGF-BB瞬时激活ERK1/2在5min时磷酸化ERK1/2表达最高,并且ERK1/2的激活能够被PD98059所抑制。PD98059也抑制PDGF-BB促进外膜成纤维细胞的迁移。结论经外膜干预ERK1/2激活可以改善损伤诱导的新生内膜形成,可能是通过抑制PDGF-BB介导的外膜成纤维细胞的迁移。

关键词：外膜成纤维细胞新生内膜形成细胞外信号调节激酶1/2

Eupatilin调控血管新生内膜形成的作用和分子机制研究

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广东药科大学学报 2019年第3期35卷 442-447页

作者：靳文李冬义劳钰刘一炫陈洁琼赵雅红广东省第二人民医院心血管内三科

目的探讨Eupatilin调控血管新生内膜形成的作用和分子机制。方法选择10~12周龄TSC1c/c SM22Cre+/-小鼠,体内实验予以行左侧颈动脉结扎制备左侧颈动脉狭窄小鼠模型后分为2组,每组8只,Sestrin2激动剂组每日予以10 mg/kg Eupatilin灌胃,对... 详细信息

目的探讨Eupatilin调控血管新生内膜形成的作用和分子机制。方法选择10~12周龄TSC1c/c SM22Cre+/-小鼠,体内实验予以行左侧颈动脉结扎制备左侧颈动脉狭窄小鼠模型后分为2组,每组8只,Sestrin2激动剂组每日予以10 mg/kg Eupatilin灌胃,对照组每日予以Sestrin2激动剂组等容量生理盐水灌胃,共持续28 d。Van Gieson染色检测左颈动脉新生内膜形成。体外实验分离和培养TSC1c/c SM22Cre+/-小鼠源性主动脉血管平滑肌细胞(AVSMCs)。予以不同终浓度Eupatilin干预AVSMCs24 h后,CCK-8检测AVSMCs增殖。予以终浓度为0、100μmol/L Eupatilin干预AVSMCs 24 h后,划痕实验检测AVSMCs迁移能力,蛋白印迹法检测AVSMCs中Sestrin2以及TSC2、S6K1、4E-BP1等分子及其磷酸化水平的表达。结果动物体内实验研究显示:与对照组相比,Eupatilin干预后TSC1c/c SM22Cre+/-小鼠的左颈动脉管腔面积增加(P内膜面积和I/M比值减少(P0.05)。结论 Eupatilin是抑制血管新生内膜形成以及AVSMCs的增殖和迁移的有效药物,与激活Sestrin2密切相关。

关键词： Eupatilin 新生内膜形成 Sestrin2

血清应答因子在血管新生内膜形成过程中的表达变化

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中国老年学杂志 2005年第3期25卷 250-252页

作者：许丽辉韩梅温进坤河北医科大学基础医学研究所河北省医学生物技术重点实验室河北石家庄050017

目的探讨SRF与VSMC表型转化及增殖之间的关系。方法建立大鼠颈总胸腹主动脉内皮剥脱后内膜增生模型,应用Northern印迹、Western印迹及免疫组化等方法从RNA和蛋白质水平上检测新生内膜形成过程中SRF表达的动态变化。结果血管内皮剥脱后3d... 详细信息

目的探讨SRF与VSMC表型转化及增殖之间的关系。方法建立大鼠颈总胸腹主动脉内皮剥脱后内膜增生模型,应用Northern印迹、Western印迹及免疫组化等方法从RNA和蛋白质水平上检测新生内膜形成过程中SRF表达的动态变化。结果血管内皮剥脱后3d,可见局部内膜增生,中膜平滑肌细胞排列不齐;术后7~14d,内膜呈进行性弥漫增厚,管腔出现狭窄。在增生的内膜中,SRF的mRNA和蛋白水平明显升高,于术后7d达高峰,其动态变化模式与血管内膜增厚速率相一致,但与收缩型VSMC的标志物SM22α的表达却呈反相关变化。结论血管内皮剥脱后SRF表达活性升高与VSMC去分化和新生内膜形成具有直接关系。

关键词：新生内膜形成血清应答因子表型转化增殖血管平滑肌细胞

全反式维甲酸对大鼠腹主动脉球囊损伤后新生内膜形成和内皮再生的影响

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中国动脉硬化杂志 2002年第1期10卷 16-18页

作者：党书毅王家宁王卫民黄永章张群林附属太和医院心内科湖北省十堰市442000 分子生物学研究所湖北省十堰市442000

为研究全反式维甲酸对球囊损伤的大鼠腹主动脉内皮再生和新生内膜形成的影响 ,制作球囊损伤的大鼠腹主动脉剥脱模型 ,将 12只血管损伤的Wistar大鼠随机分为两组 ,对照组 (n =6 )腹腔内注射脂肪乳剂 (1mL/d) ,全反式维甲酸组 (n =6 )腹... 详细信息

为研究全反式维甲酸对球囊损伤的大鼠腹主动脉内皮再生和新生内膜形成的影响 ,制作球囊损伤的大鼠腹主动脉剥脱模型 ,将 12只血管损伤的Wistar大鼠随机分为两组 ,对照组 (n =6 )腹腔内注射脂肪乳剂 (1mL/d) ,全反式维甲酸组 (n =6 )腹腔内注射溶解于脂肪乳剂的全反式维甲酸 [4 μg/ (g·d) ],球囊损伤 14天后 ,采用原位灌注固定取材 ,染色 ,进行组织学观察和形态学分析。结果显示 ,全反式维甲酸组球囊损伤血管段的内皮再生面积大于对照组 ,而新生内膜形成面积小于对照组。结果提示。

关键词：全反式维甲酸血管内膜增生血管内皮经皮冠状动脉成形术腹主动脉球囊损伤术后再狭窄内皮再生新生内膜形成