去泛素化酶USP10通过稳定血管平滑肌细胞中Skp2蛋白促进新生内膜形成

作     者：刘小林 

作者单位：广州医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘宁宁

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：新生内膜形成 平滑肌细胞 USP10 Skp2 颈动脉结扎 

摘      要：【研究背景和目的】PCI术后再狭窄是影响冠脉介入治疗患者预后的主要威胁,新生内膜形成在PCI术后再狭窄发病机理中起着关键作用,而平滑肌细胞的增殖、迁移是新生内膜形成的重要因素。泛素-蛋白酶体系统(UPS)参与多种生物学过程:细胞分裂增殖、细胞周期、细胞内信号转导和细胞凋亡等,介导真核生物大部分蛋白质的降解。去泛素化酶(DUBs)在UPS中扮演着重要的角色,目前发现的DUBs有100多种,参与了各种心血管疾病的发生发展,包括动脉粥样硬化、心肌肥大、心肌纤维化等,但其对新生内膜形成的调控机制尚不清楚。本研究旨在探讨DUB在血管新生内膜形成的作用及分子机制,以期为PCI术后再狭窄的治疗提供新的思路。【研究方法】1.通过结扎小鼠颈动脉和PDGF-BB刺激血管平滑肌细胞构建体内外新生内膜形成模型,检测USP10的表达。2.运用不同处理抑制平滑肌细胞中USP10的作用(Spautin-1抑制USP10的活性、si RNA干扰USP10的表达),研究USP10对平滑肌细胞增殖、迁移的调控作用。3.运用不同处理抑制平滑肌细胞中USP10的作用(Spautin-1抑制USP10的活性、si RNA干扰USP10的表达),研究USP10对细胞周期分子(P-Rb、Rb、CDK4、Cyclin D1、P27)的调控。4.在体外细胞增殖模型上,运用不同处理抑制USP10的作用(Spautin-1抑制USP10的活性、si RNA干扰USP10的表达),探讨USP10对平滑肌细胞中Skp2的调控作用。5.采用免疫共沉淀、免疫荧光及激光共聚焦技术,研究USP10与Skp2的相互作用。6.在体外过表达Skp2,研究USP10对平滑肌细胞增殖的影响。7.动物模型中在抑制或沉默USP10的情况下,研究USP10对新生内膜形成的影响。【研究结果】1.新生内膜形成时USP10表达增加:免疫荧光及免疫组化结果显示USP10在新生内膜中表达增加,Western blot结果显示USP10在PDGF-BB刺激的平滑肌细胞中表达增加。2.抑制或敲低USP10可抑制平滑肌细胞增殖:MTS结果显示抑制或敲低USP10可降低细胞活力,克隆形成实验结果显示Spautin-1可抑制平滑肌细胞长期增殖,Ed U实验结果显示Spautin-1抑制细胞的DNA复制,Brd U实验结果显示抑制或敲低USP10可减少Brd U的渗入。3.USP10介导VSMC细胞周期进程影响细胞增殖和迁移:流式细胞术结果显示抑制或敲低USP10可阻滞细胞周期从G0/G1期到S期的转换,Western blot结果显示抑制或敲低USP10降低周期蛋白分子的表达,细胞划痕及Transwell实验结果显示抑制或敲低USP10可阻碍平滑肌细胞迁移。4.USP10通过降低Skp2的降解调控其表达:Western blot结果显示抑制或敲低USP10可降低Skp2蛋白表达。5.USP10与Skp2相互作用且USP10稳定Skp2的表达:免疫共沉淀结果显示USP10与Skp2相互作用,抑制或敲低USP10增加了Skp2泛素化水平。6.USP10调控平滑肌细胞增殖依赖于Skp2:流式细胞术结果显示过表达Skp2可逆转抑制或敲低USP10诱导的细胞周期阻滞,Western blot结果显示过表达Skp2可挽救抑制或敲低USP10导致的p27、Cyclin D1改变。7.USP10促进新生内膜的形成:HE、免疫组化及免疫荧光染色结果显示抑制或沉默USP10新生内膜的厚度明显减少。【结论】去泛素化酶USP10通过稳定血管平滑肌细胞中Skp2蛋白促进新生内膜形成。