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拯救新城疫病毒lasota株辅助质粒的构建

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青岛农业大学学报（自然科学版） 2010年第2期27卷 139-143页

作者：康震扈荣良房丽君张守峰张乐萃青岛农业大学动物科技学院山东青岛266109 军事医学科学院军事兽医研究所吉林大学农学部畜牧兽医学院

本实验室保存的lasota株新城疫病毒经SPF鸡胚增殖,收集尿囊液并纯化病毒,提取病毒基因组RNA。参考GeneBank收录的lasota株新城疫病毒基因组序列,设计6对特异性引物,分别扩增病毒的NP、P和L1～L4六个基因片段,并将目的片段回收纯化,克隆... 详细信息

本实验室保存的lasota株新城疫病毒经SPF鸡胚增殖,收集尿囊液并纯化病毒,提取病毒基因组RNA。参考GeneBank收录的lasota株新城疫病毒基因组序列,设计6对特异性引物,分别扩增病毒的NP、P和L1～L4六个基因片段,并将目的片段回收纯化,克隆至pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,小提质粒并酶切鉴定,鉴定正确的样品进行序列测定,并比对测序结果。结果证明测序结果与GeneBank上公布的lasota株新城疫病毒序列完全一致,没有任何氨基酸和核苷酸的变化,将NP、P、L分别连接至pVAX载体,其中L1～L4为顺次连接。鉴定结果表明NP、P和L基因已正确克隆至pVAX表达载体,证明3个辅助质粒构建成功,分别命名为pVAX-NP、pVAX-P和pVAX-L。

关键词：新城疫病毒lasota株反向遗传操作辅助质粒

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新城疫（ND）核酸菌蜕疫苗的构建及免疫效果评价

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新城疫（ND）核酸菌蜕疫苗的构建及免疫效果评价

作者：密金玲西南大学

学位级别：硕士

新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)所致的一种高度接触性的传染病，能引起鸡、火鸡、鸭、鸽子和鹦鹉等多种禽类的感染和死亡，给世界养禽业造成巨大损失，因此国际兽疫局将其定为Ⅰ类传染病... 详细信息

新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)所致的一种高度接触性的传染病，能引起鸡、火鸡、鸭、鸽子和鹦鹉等多种禽类的感染和死亡，给世界养禽业造成巨大损失，因此国际兽疫局将其定为Ⅰ类传染病。目前，对该病的防制仍以疫苗免疫为主。核酸疫苗以其无致病性、研制简单、不受母源抗体干扰等诸多优点成为现代疫苗的研究热点，但研究也发现核酸疫苗存在着免疫方式有限、免疫原性不强，常需高剂量多次免疫等问题。因而，人们开始转向对核酸疫苗佐剂和载体的研究，希望能够通过各种佐剂、载体的使用来扬长补短，使其免疫效果得到进一步提高。菌蜕是通过生物分子裂解制备而成，由于G菌具有完整的生物亲和性的外膜结构，如菌毛能够进行特异的细胞和组织定位，其表面的脂多糖成分可以作为一种天然佐剂，而且菌蜕的胞周间隙和细胞空腔可接收大量外源物质，菌蜕因而成为一种新型无病原性的生物载体和靶向工具。本课题以此为着眼点，以分子裂解方法制备的菌蜕作为载体，与构建表达NDV F基因的核酸疫苗制备成新城疫核酸菌蜕疫苗，并进行实验动物(鸡)的免疫试验。主要研究内容如下： 1．表达新城疫F基因核酸疫苗的构建根据GeneBank中公布的lasota株F基因的核苷酸序列(AF077761)设计引物，并分别在上下游引入BamHⅠ和KpnⅠ限制性内切酶位点，以利于插入真核表达载体pcDNA3.1+。以新城疫lasota弱毒株为研究材料，提取出基因组RNA并以其为模板，通过RT-PCR技术扩增新城疫病毒F基因完整片断，扩增产物经纯化回收后与pMD18-T载体相连，转化DH5a感受态细胞，经PCR和酶切电泳鉴定，均得到了大小约1700bp左右的条带，证实扩增产物已插入T载体。获得的重组质粒pT-F经双酶切将F基因插入到pcDNA3.1+载体中，PCR和酶切鉴定显示表达新城疫F基因的核酸疫苗pcDNA3-F构建成功。 2．大肠杆菌DH5a菌蜕的制备菌蜕是由裂解蛋白E介导的G菌的裂解而产生，编码有噬菌体PhiX174基因E的裂解质粒，可在温敏阻遏元件cI857的控制下进行E基因的限制性表达。在温度低于30℃时，阻遏蛋白cI857的表达使基因E能被很好地抑制，温度高于30℃时，因阻遏蛋白cI857的热失活而使基因E开始表达，在42℃时细菌的裂解达到最佳状态。将含有裂解质粒(pHH43)的大肠杆菌DH5a于28℃200rpm摇床培养，为获得最大量的菌蜕，当OD=0.4～0.6时，迅速升高温度至42℃以启动E裂解蛋白的表达并开始计时，4小时后收集菌蜕。菌落计数(CFU)结果表明有99.998％的细菌被有效裂解。扫描电镜观察可见裂解孔道位于细菌一端或中间，而胞内的物质已经排出，菌蜕保留了较完整的外膜，细菌形态没有发生太大改变。 3．新城疫核酸菌蜕疫苗的制备将菌蜕重悬于含有质粒pcDNA3-F的PBS(pH7.4)体系中，加入终浓度25mM CaCl溶液，随后在不同条件下，150rpm摇床孵育。为确定质粒DNA的最佳构建浓度，将菌蜕与不同浓度的质粒DNA(5～14mg／ml)孵育，37℃30min后离心收集沉淀和上清;为确定最佳构建温度，将菌蜕与pcDNA3-F(10mg／ml)在不同的温度下进行孵育(4℃、25℃、37℃)，30min后离心收集沉淀和上清;为确定孵育时间，将菌蜕与pcDNA3-F(10mg／ml)，于25℃进行孵育，分别在2min、4min、10min、30min、60min、120min、180min时，离心收集沉淀和上清。所有离心均为8000rpm 10min，收集的上清通过测定OD以确定DNA的量。通过改变DNA的浓度、孵育温度和孵育时间发现，装载前DNA的浓度与菌蜕中DNA的量成正相关，孵育温度与装载效果没有明显关联，孵育时间2min足够。 4．新城疫核酸菌蜕疫苗免疫效果的评定将7日龄健康雏鸡随机分为7组，每组30只，分别为PBS对照组(Ⅰ组)，pcDNA3.1+对照组(Ⅱ组)，裸DNA疫苗(pcDNA3-F)组(Ⅲ组)，lasota弱毒疫苗组(Ⅳ组)，新城疫核酸菌蜕苗滴鼻组(Ⅴ组)，新城疫核酸菌蜕苗口服组(Ⅵ组)，新城疫核酸菌蜕苗肌注组(Ⅶ组)。两周后每组各以相同的剂量和途径进行加强免疫一次，二免后第2周用新城疫强毒分离株进行攻毒。通过间接ELISA、血凝抑制抗体检测及攻毒保护试验，对新城疫核酸疫苗的免疫效价进行初步的评定。间接ELISA试验结果表明：首免后一周，与PBS和pcDNA3.1+对照组相比，pcDNA3-F组、lasota弱毒疫苗组和新城疫核酸菌蜕疫苗组OD值已有所升高，说明所构建的核酸疫苗已在雏鸡体中进行了表达，表达产物作为抗原刺激机体产生了免疫应答反应;首免后两周，除对照组外的所有免疫组的OD值均有显著

关键词：新城疫病毒lasota株 F基因核酸疫苗菌蜕核酸菌蜕疫苗

MPAIV、NDV lasota株分别与较低致病性禽源***的联合感染试验

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动物医学进展 2001年第4期22卷 72-74页

作者：高崧彭大新甘军纪吴艳涛张如宽刘秀梵扬州大学畜牧兽医学院动物医学系扬州225009

以 2× 1 0 5EID50 的低致病性禽流感病毒 ( mildly pathogenic avian influenza virus,MPAIV)、2× 1 0 6 EID50 新城疫病毒 L asota株( Newcastle disease virus lasota strain,NDVL asota)气管内注射 1 0日龄 SPF鸡 ,2 4h后 ,同剂量、同法重复感染一次 ;48h后 ,分别气管内注射较低致病性禽病原性大肠杆菌 1 2 0( O1 8)和 1 73( O2 6 )株 ,2× 1 0 7CFU/羽 ,2 4h后同剂量、同法重复攻毒一次 ,连续观察 1 0d。结果 :MPAIV单独感染组死亡率为 53% ;NDV lasota株单独攻毒组未见死亡 ;大肠杆菌 1 2 0株单独攻毒组死亡率为 40 % ,1 73株单独攻毒组死亡率为 7% ;MPAIV与大肠杆菌1 2 0株联合攻毒组的死亡率为 87% ,NDV L a-sota株与 1 2 0株联合攻毒组的死亡率为 40 % ;MPAIV与大肠杆菌 1 73株联合攻毒组的死亡率为 80 % ,NDV lasota株与 1 73株联合攻毒组的死亡率为 2 0 %。

关键词：家禽大肠杆菌低致病性禽流感病毒新城疫病毒lasota株人工感染协同致病作用联合感染

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鸡新城疫La Sota株、鸡传染性支气管炎W_(93)株二联活疫苗研究 Ⅱ.接毒剂量选择试验

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中国兽药杂志 2003年第9期37卷 21-23页

作者：苗玉和卫广森王文成康连伟任秀颖赵冰开辽宁省益康生物制品厂辽宁辽阳111000

　将鸡新城疫lasota毒种和嗜肾型鸡传染性支气管炎W93毒种分别用生理盐水做适当稀释后,将两种病毒液等量混合,接种于同一SPF鸡胚尿囊腔内。结果表明,IBV、NDV在同一鸡胚内增殖时无互相干扰现象;收获的鸡胚液(lasota+W93)中NDV、IBV的效... 详细信息

　将鸡新城疫lasota毒种和嗜肾型鸡传染性支气管炎W93毒种分别用生理盐水做适当稀释后,将两种病毒液等量混合,接种于同一SPF鸡胚尿囊腔内。结果表明,IBV、NDV在同一鸡胚内增殖时无互相干扰现象;收获的鸡胚液(lasota+W93)中NDV、IBV的效价分别达到相应单苗水平。

关键词：鸡新城疫病毒lasota株传染性支气管炎病毒W93株二联疫苗活疫苗接毒剂量选择试验

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鸡新城疫低毒力耐热保护剂活疫苗—锐必新

兽药市场指南 2005年第12期 14-14页

作者：王根宝杨保收尤永君厉从志梁剑峰肖亚彬瑞普（保定）生物药业有限公司河北省辛集市畜牧局

鸡新城疫低毒力耐热保护剂活疫苗——锐必新是瑞普（保定）生物药业有限公司以围外引进配方为基础。以鸡新城疫病毒lasota株为种毒研制出的耐热保护剂活疫苗系列产品之一。经检验，锐必新各项指标已达到国外同类产品质量标准，达到国内... 详细信息

鸡新城疫低毒力耐热保护剂活疫苗——锐必新是瑞普（保定）生物药业有限公司以围外引进配方为基础。以鸡新城疫病毒lasota株为种毒研制出的耐热保护剂活疫苗系列产品之一。经检验，锐必新各项指标已达到国外同类产品质量标准，达到国内领先水平。2005年9月22日，该产品已获农业部核发的《新兽药注册证书》【证号：（2005）新兽药证字30号】。

关键词：耐热保护剂鸡新城疫活疫苗新城疫病毒lasota株毒力产品质量标准系列产品有限公司生物药业农业部