新城疫（ND）核酸菌蜕疫苗的构建及免疫效果评价

作     者：密金玲 

作者单位：西南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：聂奎

授予年度：2007年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：新城疫病毒Lasota株 F基因 核酸疫苗 菌蜕 核酸菌蜕疫苗 

摘      要：新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)所致的一种高度接触性的传染病，能引起鸡、火鸡、鸭、鸽子和鹦鹉等多种禽类的感染和死亡，给世界养禽业造成巨大损失，因此国际兽疫局将其定为Ⅰ类传染病。目前，对该病的防制仍以疫苗免疫为主。核酸疫苗以其无致病性、研制简单、不受母源抗体干扰等诸多优点成为现代疫苗的研究热点，但研究也发现核酸疫苗存在着免疫方式有限、免疫原性不强，常需高剂量多次免疫等问题。因而，人们开始转向对核酸疫苗佐剂和载体的研究，希望能够通过各种佐剂、载体的使用来扬长补短，使其免疫效果得到进一步提高。菌蜕是通过生物分子裂解制备而成，由于G菌具有完整的生物亲和性的外膜结构，如菌毛能够进行特异的细胞和组织定位，其表面的脂多糖成分可以作为一种天然佐剂，而且菌蜕的胞周间隙和细胞空腔可接收大量外源物质，菌蜕因而成为一种新型无病原性的生物载体和靶向工具。本课题以此为着眼点，以分子裂解方法制备的菌蜕作为载体，与构建表达NDV F基因的核酸疫苗制备成新城疫核酸菌蜕疫苗，并进行实验动物(鸡)的免疫试验。主要研究内容如下： 1．表达新城疫F基因核酸疫苗的构建根据GeneBank中公布的Lasota株F基因的核苷酸序列(AF077761)设计引物，并分别在上下游引入BamHⅠ和KpnⅠ限制性内切酶位点，以利于插入真核表达载体pcDNA3.1+。以新城疫Lasota弱毒株为研究材料，提取出基因组RNA并以其为模板，通过RT-PCR技术扩增新城疫病毒F基因完整片断，扩增产物经纯化回收后与pMD18-T载体相连，转化DH5a感受态细胞，经PCR和酶切电泳鉴定，均得到了大小约1700bp左右的条带，证实扩增产物已插入T载体。获得的重组质粒pT-F经双酶切将F基因插入到pcDNA3.1+载体中，PCR和酶切鉴定显示表达新城疫F基因的核酸疫苗pcDNA3-F构建成功。 2．大肠杆菌DH5a菌蜕的制备菌蜕是由裂解蛋白E介导的G菌的裂解而产生，编码有噬菌体PhiX174基因E的裂解质粒，可在温敏阻遏元件cI857的控制下进行E基因的限制性表达。在温度低于30℃时，阻遏蛋白cI857的表达使基因E能被很好地抑制，温度高于30℃时，因阻遏蛋白cI857的热失活而使基因E开始表达，在42℃时细菌的裂解达到最佳状态。将含有裂解质粒(pHH43)的大肠杆菌DH5a于28℃200rpm摇床培养，为获得最大量的菌蜕，当OD=0.4～0.6时，迅速升高温度至42℃以启动E裂解蛋白的表达并开始计时，4小时后收集菌蜕。菌落计数(CFU)结果表明有99.998％的细菌被有效裂解。扫描电镜观察可见裂解孔道位于细菌一端或中间，而胞内的物质已经排出，菌蜕保留了较完整的外膜，细菌形态没有发生太大改变。 3．新城疫核酸菌蜕疫苗的制备将菌蜕重悬于含有质粒pcDNA3-F的PBS(pH7.4)体系中，加入终浓度25mM CaCl溶液，随后在不同条件下，150rpm摇床孵育。为确定质粒DNA的最佳构建浓度，将菌蜕与不同浓度的质粒DNA(5～14mg／ml)孵育，37℃30min后离心收集沉淀和上清;为确定最佳构建温度，将菌蜕与pcDNA3-F(10mg／ml)在不同的温度下进行孵育(4℃、25℃、37℃)，30min后离心收集沉淀和上清;为确定孵育时间，将菌蜕与pcDNA3-F(10mg／ml)，于25℃进行孵育，分别在2min、4min、10min、30min、60min、120min、180min时，离心收集沉淀和上清。所有离心均为8000rpm 10min，收集的上清通过测定OD以确定DNA的量。通过改变DNA的浓度、孵育温度和孵育时间发现，装载前DNA的浓度与菌蜕中DNA的量成正相关，孵育温度与装载效果没有明显关联，孵育时间2min足够。 4．新城疫核酸菌蜕疫苗免疫效果的评定将7日龄健康雏鸡随机分为7组，每组30只，分别为PBS对照组(Ⅰ组)，pcDNA3.1+对照组(Ⅱ组)，裸DNA疫苗(pcDNA3-F)组(Ⅲ组)，Lasota弱毒疫苗组(Ⅳ组)，新城疫核酸菌蜕苗滴鼻组(Ⅴ组)，新城疫核酸菌蜕苗口服组(Ⅵ组)，新城疫核酸菌蜕苗肌注组(Ⅶ组)。两周后每组各以相同的剂量和途径进行加强免疫一次，二免后第2周用新城疫强毒分离株进行攻毒。通过间接ELISA、血凝抑制抗体检测及攻毒保护试验，对新城疫核酸疫苗的免疫效价进行初步的评定。间接ELISA试验结果表明：首免后一周，与PBS和pcDNA3.1+对照组相比，pcDNA3-F组、Lasota弱毒疫苗组和新城疫核酸菌蜕疫苗组OD值已有所升高，说明所构建的核酸疫苗已在雏鸡体中进行了表达，表达产物作为抗原刺激机体产生了免疫应答反应;首免后两周，除对照组外的所有免疫组的OD值均有显著