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断裂蛋白质内含子介导的多肽环化

断裂蛋白质内含子介导的多肽环化

作者：汪双祝东华大学

学位级别：硕士

环肽是一类结构稳定,生物活性广泛的环状化合物,具有广泛的应用价值。特别是环形抗菌肽,具有对热稳定、抗菌谱广、分子量小、免疫原性低等特点,由于其杀菌机制独特、不易产生耐药性,有望开发成为新一代肽类抗生素。设计、改造和制备天... 详细信息

环肽是一类结构稳定,生物活性广泛的环状化合物,具有广泛的应用价值。特别是环形抗菌肽,具有对热稳定、抗菌谱广、分子量小、免疫原性低等特点,由于其杀菌机制独特、不易产生耐药性,有望开发成为新一代肽类抗生素。设计、改造和制备天然环肽,并进一步研究其作用机理,提高抗菌活性等显得尤为重要。而环肽制备常用的方法是化学合成法,该方法存在一定的局限性,如成本高、易形成多聚体副产物和环化步骤繁琐等。本研究利用断裂蛋白质内含子介导的蛋白质反式剪接技术进行环形抗菌肽的制备。该方法为酶学反应,可以在生理条件下发生,且所需分子浓度低。断裂蛋白质内含子是蛋白质内含子中的一种,能够自我催化介导蛋白质反式剪接而形成成熟的蛋白质。断裂蛋白质内含子剪接结构域分为N-端剪接结构域(I)与C-端剪接结构域(I),它们可以分别位于不同的编码阅读框。在蛋白质反式剪接中,N-端剪接结构域与C-端剪接结构域相互识别,通过非共价键相互作用,重建剪接活性中心,从而进行自我催化从前体蛋白质中切除下来,而两端的蛋白质外显子以新的肽键相连。因此多肽环化中,将目标多肽插入断裂蛋白质内含子的两端剪接结构域之间,通过反式剪接,使多肽首尾相连得以环化。本研究选用了AS-48、Garvicin ML、Butyrivibriocin AR10和Uberolysin四种细菌素,它们是一类由不同细菌产生的具有较强抗菌活性的天然环肽。同时选取了本课题组中经筛选后活性较高、通用性较好的两种新型断裂蛋白质内含子CPE和RB。首先采用PCR、重叠延伸PCR方法克隆构建了两种通用载体,分别在两种断裂蛋白质内含子的C-端剪接区域和N-端剪接区域中插入标签序列Flag作为连接子。随后,通过无缝克隆(不引入任何外源氨基酸),通用载体中的Flag序列分别被4种细菌素序列取代,使细菌素插在两端剪接区域之间,构建了8种重组表达质粒。经过对蛋白诱导表达条件的摸索,结果表明重组表达质粒中只有两种细菌素Butyrivibriocin AR10和Uberolysin在大肠杆菌中成功表达,其18℃表达时主要以可溶性形式存在于上清中,37℃表达时主要存在于沉淀中。通过分析发现重组蛋白中只有细菌素Uberolysin在RB的介导下成功发生剪接,但体内剪接率低,环肽分子量小,难以检测与纯化。在后续实验中,本文对不同温度诱导下的该重组蛋白采用了变性纯化与非变性纯化,对纯化后的蛋白进行体外剪接,发现其在体外基本不剪接。为了进一步验证Uberolysin的环化,对该重组蛋白进行了改造,引入了小分子蛋白标签C-Myc,通过SDS-PAGE、Tris-Tricine-SDS-PAGE和Western Blot等技术来检测环肽Uberolysin。初步结果显示,细菌素Uberolysin在断裂蛋白质内含子RB的介导下成功在大肠杆菌体内发生剪接并得以环化。后续可进一步通过HPLC及质谱鉴定环肽的存在。该方法为细菌素的制备提供了新的途径,也进一步为拓展环形抗菌肽的应用打下基础。

关键词：环肽断裂蛋白质内含子蛋白质的反式剪接多肽环化

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断裂蛋白质内含子介导的蛋白质两端标记

断裂蛋白质内含子介导的蛋白质两端标记

作者：张晓玲东华大学

学位级别：硕士

蛋白质标记是蛋白质的结构、功能及其相互作用研究中必不可少的工具。现今，随着蛋白标记技术的不断发展和成熟，多位点特异性标记蛋白质方法在生命科学多个领域有着广泛应用，尤其是在研究蛋白质动态构像以及动力学分析中起到了重要作... 详细信息

蛋白质标记是蛋白质的结构、功能及其相互作用研究中必不可少的工具。现今，随着蛋白标记技术的不断发展和成熟，多位点特异性标记蛋白质方法在生命科学多个领域有着广泛应用，尤其是在研究蛋白质动态构像以及动力学分析中起到了重要作用，例如单分子荧光共振能量转移（smFRET）。为实现蛋白质多位点特异性标记，目前已经发展了多种基于化学和/或分子生物学的蛋白质标记方法，但是各自都存在自身的缺陷，不能很好地实现蛋白质多位点特异性标记。蛋白质反式剪接技术（protein trans-splicing）的发展为蛋白质的标记开辟了新途径。蛋白质反式剪接反应是由断裂蛋白质内含子（split-intein）介导，断裂蛋白质内含子在蛋白质内含子内部区域特定位点发生断裂，形成N-端蛋白（IN）和C-端蛋白（IC），分别由基因组上相距较远的两个开放阅读框（open reading frame，ORF）编码。在蛋白质翻译后成熟过程中，IN和IC相互识别，重建催化活性中心，催化反式剪接反应发生。蛋白质外显子（exteins）通过肽键相连接，形成成熟的蛋白质，IN和IC在蛋白质成熟过程中自我剪切下来。现今利用断裂蛋白质内含子介导的蛋白质反式剪接已经实现蛋白质的N和C端的单一特异性蛋白质标记，Yang等人2009年实现了蛋白质两端的特异性标记。本论文利用两种不同的断裂蛋白质内含子同样实现蛋白质两端的特异性标记，相比已有的标记方法有许多优越性，并且实现蛋白质两端特异性同时标记，方法优于yang实验室的蛋白质两端特异性标记方法。本课题选取SG-S1、SX-S1、TX-S1和TE3-S11断裂蛋白质内含子，其中S1型断裂蛋白质内含子的N端仅含有12个氨基酸，S11型断裂蛋白质内含子的C端仅含有6个氨基酸，用于重组蛋白质N末端或C末端荧光染料标记。将S1型断裂内含子C端和S11型断裂内含子N端分别与靶蛋白diUb的N端和C端融合，形成M端前体蛋白;荧光染料FITC标记S1型断裂内含子N端，形成N端前体蛋白;荧光染料Alexa594标记S11型断裂内含子C端，形成C端前体蛋白。化学方法合成荧光标记的N端前体蛋白，利用Ni2+-NTA纯化得到M端前体蛋白和C端前体蛋白，筛选合适的M端前体蛋白。N端前体蛋白、M端前体蛋白和C端前体蛋白按摩尔比1：1：1进行反式剪接反应，通过优化反应条件和C端前体蛋白优化反式剪接反应，通过荧光扫描、SDS-PAGE和质谱检测技术，检测是否产生两端特异性标记蛋白产物。研究结果表明，本文实现了蛋白质两端特异性同时标记。相比已有的标记方法，具有特异性，通用性、操作简捷等优点。开辟了新的蛋白质多位点特异性标记方法，使蛋白质标记不再局限于传统的氨基酸特异性标记。在蛋白质工程和蛋白质构象动态学研究中有着潜在的应用价值。

关键词：断裂蛋白质内含子蛋白质反式剪接 N端和C端标记荧光基团

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应用突变的断裂蛋白质内含子标记蛋白质N端

中国生物化学与分子生物学报 2014年第5期30卷 508-515页

作者：戴旭东李佳刘相钦孟清东华大学生物科学与技术研究所上海201620 达尔豪斯大学生物化学与分子生物学系 HalifaxNova Scotia B3H 4R2Canada

蛋白质的特异位点修饰可以帮助了解蛋白质的结构与功能.但是,现有的蛋白质特异位点标记方法种类有限,而且存在局限性,所以有必要开发新的蛋白质特异位点标记方法.以谷胱甘肽-S-转移酶(GST)为研究对象,借助蛋白质反式剪接技术,建立了利... 详细信息

蛋白质的特异位点修饰可以帮助了解蛋白质的结构与功能.但是,现有的蛋白质特异位点标记方法种类有限,而且存在局限性,所以有必要开发新的蛋白质特异位点标记方法.以谷胱甘肽-S-转移酶(GST)为研究对象,借助蛋白质反式剪接技术,建立了利用新型断裂蛋白质内含子对蛋白质进行N端标记的新方法.在这个方法中,通过简单的重组表达、标记和纯化得到带有荧光基团的小肽,经过蛋白质反式剪接,荧光基团被标记到蛋白质的N端.初步研究结果显示,标记效率可达到12%.

关键词：断裂蛋白质内含子蛋白质剪接 N端标记荧光基团

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高剪接活性断裂蛋白质内含子的体内切割

中国生物工程杂志 2011年第8期31卷 97-101页

作者：林瑛周倩荀启静孟清东华大学生物科学与技术研究所上海201620

蛋白质内含子介导的断裂(切割)反应被用于蛋白质纯化、连接和环化等,但目前仍存在断裂效率低、断裂反应的不可控、产物复杂等问题。蛋白质内含子的定点突变可导致其N端或C端断裂。其末位氨基酸突变则剪接反应第3步天冬酰胺环化无法进行... 详细信息

蛋白质内含子介导的断裂(切割)反应被用于蛋白质纯化、连接和环化等,但目前仍存在断裂效率低、断裂反应的不可控、产物复杂等问题。蛋白质内含子的定点突变可导致其N端或C端断裂。其末位氨基酸突变则剪接反应第3步天冬酰胺环化无法进行,发生N端断裂;其首位氨基酸发生突变则剪接反应第一步酰基重排及其后续步骤均无法进行,而天冬酰胺环化仍可进行,发生C端断裂。利用已获得的高剪接活性的S1和S11型断裂蛋白质内含子Ssp GyrB,分别将其参与剪接反应的首位半胱氨酸或末位天冬酰胺突变为丙氨酸,构建能够发生一端断裂的断裂蛋白质内含子。研究结果表明,突变后断裂蛋白质内含子的剪接反应几乎不发生,其断裂活性有不同程度的提高,获得了在大肠杆菌体内具有较高效断裂活性的断裂蛋白质内含子。这将为进一步研究其体外可控性剪接、构建高效的蛋白纯化系统和深入研究蛋白质内含子的剪接机制提供基础。

关键词：蛋白质内含子断裂蛋白质内含子定点突变

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新型T+1断裂蛋白质内含子的构建

东华大学学报（自然科学版） 2012年第1期38卷 50-54页

作者：王瑾林瑛郑言成孟清东华大学生物科学与技术研究所上海201620

首次从天然C端外显子为苏氨酸(Thr)的标准蛋白质内含子(TerSnf2)构建出两类T+1型断裂蛋白质内含子:Snf-S0和Snf-S1,通过蛋白印迹法测定Snf-S0和Snf-S1介导的蛋白质反式剪接效率分别达到53.5%和33.3%;当这两类断裂蛋白质内含子C端外显子... 详细信息

首次从天然C端外显子为苏氨酸(Thr)的标准蛋白质内含子(TerSnf2)构建出两类T+1型断裂蛋白质内含子:Snf-S0和Snf-S1,通过蛋白印迹法测定Snf-S0和Snf-S1介导的蛋白质反式剪接效率分别达到53.5%和33.3%;当这两类断裂蛋白质内含子C端外显子分别为半胱氨酸(Cys)和丝氨酸(Ser)时均具有剪接活性.所获的两类具有剪接活性的T+1型断裂蛋白质内含子具备一定的插入位点通用性,这一特点为蛋白质反式剪接技术在蛋白质工程领域广泛应用提供了新的契机.

关键词：断裂蛋白质内含子蛋白质反式剪接 Ter Snf2

构建及筛选S1型断裂蛋白质内含子用于蛋白质定点标记

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构建及筛选S1型断裂蛋白质内含子用于蛋白质定点标记

作者：荀启静东华大学

学位级别：硕士

蛋白质内含子是位于宿主蛋白质中的插入序列,在蛋白成熟过程中自我去除,并以肽键连接两侧的宿主蛋白质序列（称为蛋白外显子）,蛋白质这一成熟过程被称为蛋白质剪接。断裂蛋白质内含子是指蛋白质内含子被分裂成两部分即N端区域（IN）和... 详细信息

蛋白质内含子是位于宿主蛋白质中的插入序列,在蛋白成熟过程中自我去除,并以肽键连接两侧的宿主蛋白质序列（称为蛋白外显子）,蛋白质这一成熟过程被称为蛋白质剪接。断裂蛋白质内含子是指蛋白质内含子被分裂成两部分即N端区域（IN）和C端区域（IC）,分别由不同的开放阅读框表达。断裂蛋白质内含子的独特性是能够分段表达或合成,并且能够特异性识别,为蛋白质合成和修饰提供了新的途径,因而在蛋白质工程及其它领域具有广泛的应用前景。在蛋白质标记领域,应用新型断裂蛋白质内含子对目的蛋白特异位点进行修饰或标记,有助于更深入地研究目的蛋白的结构和功能。目前在蛋白质标记领域中所采用的是人工构建的断裂蛋白质内含子,该方法用于定点标记的局限性在于：（1）异源宿主中蛋白质剪接效率可能大大降低甚至不能发生剪接反应,并且其剪接需要的蛋白质外显子的氨基酸也是特定的,限制了蛋白质内含子的应用范围;（2）大片段的断裂蛋白质内含子与目的蛋白进行融合表达,这样可能造成目的蛋白可溶性的改变或其它不可知的影响;（3）人工合成小肽增加了实验成本等。为克服上述局限性,本课题构建6个新型的S1型断裂蛋白内含子,将其C端半胱氨酸突变为丝氨酸,并且将两侧的天然外显子替换为一段通用性高的连接小肽（GG-SAG）,对新型断裂蛋白质内含子体内和体外的剪接活性进行检测,筛选出合适的断裂蛋白质内含子进行应用。本文利用实验室已有的微小蛋白质内含子进行改造,成功构建了6个C端无半胱氨酸的S1型断裂蛋白质内含子（称为CF-intein）,通过对体内剪接活性的分析,筛选出3个具有相对较高剪接活性的断裂蛋白质内含子（CFRBS1, CFTXS1和CFSXS1）进行体外剪接活性检测。结果分析表明：CFRBS1 intein具有较稳定的剪接活性,较高的剪接活性以及较快的剪接速率;同时模式蛋白的标记检测结果也显示,CFRBS1 intein可进行蛋白质定点标记应用。本课题中期望改造后的S1型断裂蛋白质内含子在进行应用时,特异性较高,不仅可以带上荧光基团、标签等,对于富含半胱氨酸的蛋白也能进行定点标记,并且不需要对目的蛋白进行突变或其它改造。由于C端不含有半胱氨酸,能够避免蛋白质内含子与目的蛋白的巯基形成二硫键。同时所构建的蛋白质内含子的两边已经不是其天然蛋白质外显子,替换成一段连接小肽,这样可以提高其通用性,利于蛋白质工程的实际应用。本课题不仅仅是对前人的研究作为一个补充,更为提高蛋白质内含子在异源蛋白中的适应能力,为拓宽其应用范围打下坚实的基础。

关键词：断裂蛋白质内含子蛋白质剪接定点突变定点标记

新型断裂蛋白质内含子介导的蛋白质内部位点特异性标记

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新型断裂蛋白质内含子介导的蛋白质内部位点特异性标记

作者：张露东华大学

学位级别：硕士

蛋白质的标记和修饰对于研究蛋白质的功能和结构是不可或缺的。目前,随着蛋白质标记和修饰技术的不断发展和成熟,蛋白质位点特异性的标记在生物领域有着大量的潜在应用。其中在蛋白质的功能研究方面起到了重要作用,例如研究信号通路相... 详细信息

蛋白质的标记和修饰对于研究蛋白质的功能和结构是不可或缺的。目前,随着蛋白质标记和修饰技术的不断发展和成熟,蛋白质位点特异性的标记在生物领域有着大量的潜在应用。其中在蛋白质的功能研究方面起到了重要作用,例如研究信号通路相关蛋白质时,就需要体外表达目标蛋白且进行标记或修饰;另外利用核磁共振测目标蛋白结构时,也需要对目标蛋白进行标记。为了达到目标蛋白位点特异性的修饰和标记,目前,存在很多基于分子生物学和化学的蛋白质标记或修饰的方法,但是它们都有自身的缺点,且大部分只能做到对目标蛋白质末端位点的标记做不到内部位点的特异性的标记。蛋白质的反式剪接(protein trans-splicing)技术可以说是为蛋白质位点特异性的标记提供了新的方法。首先,蛋白质的反式剪接即由断裂蛋白质内含子介导的。断裂蛋白质内含子的特点是由两部分组成,命名为断裂蛋白质内含子的N端()和断裂蛋白质内含子的C端(),它们分别位于两个开放阅读框中(open reading frame,ORF)。当N端和C端的蛋白质内含子分别翻译成熟后,和能够重新识别,并且形成具有催化功能的活性中心,从而进行蛋白质的反式剪接。最终断裂蛋白质内含子被剪切下来,蛋白质内含子两侧的外显子通过肽键连接起来。目前利用断裂蛋白质内含子已经实现了蛋白质末端的标记与修饰,但是仍然没有做到蛋白质内部位点特异性的标记与修饰。而本文实现了对蛋白质内部位点的特异性标记。这也是首次利用断裂蛋白质内含子实现蛋白质的内部标记。本课题最终选取了TE3S11和RBS1两种新型的断裂蛋白质内含子。其中S1型断裂蛋白质内含子的N端仅包含有11个氨基酸,S11型断裂蛋白质内含子的C端仅包含有6个氨基酸。可用于目标蛋白位点特异性的荧光基团的标记。将麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)和TE3S11N(S11型断裂蛋白质内含子的N端)融合,形成N端前体蛋白;TE3S11C(S11型断裂蛋白质内含子的C端)、标有荧光基团FITC的赖氨酸和RBS1N(S1型断裂蛋白质内含子的N端)融合形成中间前体蛋白;RBS1C(S1型断裂蛋白质内含子的C端)与硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)融合形成C端前体蛋白。化学法合成中间前体蛋白。利用Amylose Resin纯化可得到N端前体蛋白,利用Ni-NTA纯化可得到C端前体蛋白。三种前体蛋白需要按照摩尔比1:1:1在室温下进行蛋白质的反式剪接,最后通过SDS-PAGE、Western Blot、荧光扫描以及质谱鉴定终产物,判断是否可以实现蛋白质内部位点特异性的标记。最终结果表明,本文实现了对目标蛋白内部位点特异性的标记。相比较已有的技术,本文中涉及到的技术更为简便、通用和真正实现了蛋白质内部位点的特异性标记。为蛋白质的标记开辟了新的方法。在蛋白质工程中具有很大的潜在应用。

关键词：位点特异性标记断裂蛋白质内含子蛋白质的反式剪接荧光基团FITC

DNA展示系统介导的断裂蛋白质内含子体外定向进化方法的研究

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中国生物化学与分子生物学报 2016年第10期32卷 1121-1131页

作者：林森珠陈格飞孟清东华大学生物科学与技术研究所上海201620 卡罗林斯卡学院老年痴呆研究中心瑞典斯德哥尔摩14157

蛋白质内含子对于外显子的选择性限制了它的应用范围。目前,已经建立的卡那霉素定向进化系统适用于微小蛋白质内含子,但不适用于断裂蛋白质内含子。为了研究适用于断裂蛋白质内含子的定向进化的方法,我们引入了DNA展示系统。在该系统中... 详细信息

蛋白质内含子对于外显子的选择性限制了它的应用范围。目前,已经建立的卡那霉素定向进化系统适用于微小蛋白质内含子,但不适用于断裂蛋白质内含子。为了研究适用于断裂蛋白质内含子的定向进化的方法,我们引入了DNA展示系统。在该系统中,生物素化基因在人工细胞中与其表达的融合蛋白(内含子C端-外显子-生物素结合蛋白)形成DNA-蛋白质连接体。只有能与后续加入的N端蛋白质内含子前体(Flag-内含子N端)发生剪接反应的DNA-蛋白质连接体,才能被加上旗帜标签(Flag),从而被抗旗帜标签抗体纯化柱(Anti Flag antibody M2 agarose)筛选富集。为了验证该系统的可行性,实验构建了2个基因,即含有具剪接活性的蛋白质内含子的阳性基因IRC和含有不具剪接活性的蛋白质内含子的阴性基因IRCM。实验首先通过Western印迹和琼脂糖凝胶电泳证明,人工细胞中的体外转录翻译系统不仅可高表达500个氨基酸的蛋白质,而且表达的蛋白中内含子仍保持原有的剪接能力。生物素结合蛋白能结合95%的DNA,并且形成的DNA-蛋白质连接体可以被筛选富集,最终证明了该系统用于断裂蛋白质内含子定向进化筛选的可行性。随后,为了检测系统的富集效率,制备了人为的基因"突变库",即将基因IRC和IRCM以摩尔比1:10的比例混合,经过2轮筛选后,阳性基因IRC可以被10倍富集,进一步证明了体外筛选方法的可行性。该方法为后续针对不同宿主进化出不同的断裂蛋白质内含子提供筛选方法支持,也为断裂蛋白质内含子的在生物技术和研究领域的应用奠定了基础。

关键词：断裂蛋白质内含子体外定向进化 DNA展示系统人工细胞体外转录翻译系统

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新型断裂蛋白质内含子体外剪接动力学的研究

新型断裂蛋白质内含子体外剪接动力学的研究

作者：李梦梦东华大学

学位级别：硕士

蛋白质内含子(intein)是镶嵌在宿主蛋白质中的插入序列,在宿主蛋白质成熟过程中能够自我剪切下来,同时将两侧的序列—蛋白质外显子(exteins)通过肽键相连接,形成成熟的蛋白质。蛋白质的这一成熟过程被称为蛋白质顺式剪接(protein cis-sp... 详细信息

蛋白质内含子(intein)是镶嵌在宿主蛋白质中的插入序列,在宿主蛋白质成熟过程中能够自我剪切下来,同时将两侧的序列—蛋白质外显子(exteins)通过肽键相连接,形成成熟的蛋白质。蛋白质的这一成熟过程被称为蛋白质顺式剪接(protein cis-splicing)。断裂蛋白质内含子(split-intein)是在蛋白质内含子内部区域特定位点发生断裂,形成N-端蛋白(IN)和C-端蛋白(Ic),分别由基因组上相距较远的两个开放阅读框(open reading frame, ORF)编码。在翻译后成熟过程中,IN和Ic相互识别,重建催化活性中心,介导蛋白质反式剪接(protein trans-splicing)。通过人工改造断裂蛋白质内含子的断裂位点,使之靠近蛋白质内含子的N-末端或C-末端,即形成了新型断裂蛋白质内含子。断裂蛋白质内含子介导的蛋白质反式剪接技术在蛋白质纯化、基因治疗、环状多肽制备以及大分子复杂蛋白质的生产方面已取得了一些成果。新型断裂蛋白质内含子在此基础上扩大了断裂蛋白质内含子的应用,提供了在目的蛋白质的N-末端或C-末端标记任意化学基团的潜力。在进行应用之前需要对这一反应的酶促动力学进行全面的了解,因而,新型断裂蛋白质内含子剪接动力学的研究显得十分重要。本课题选取新型断裂蛋白质内含子SX-S1、TX-S1、SX-S11和TE3-S11进行剪接动力学的研究。本研究中S1型断裂蛋白质内含子的N端仅含有11个氨基酸,S11型断裂蛋白质内含子的C端仅含有6个氨基酸,易于化学合成,可以应用于重组蛋白质或药物的N-末端或C-末端荧光素、生物素等标记。构建只含有N端前体蛋白或C端前体蛋白相应序列的表达质粒,麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein, MBP)与IN组成的融合蛋白为N端前体蛋白;IC与硫氧还蛋白(thioredoxin, T)组成的融合蛋白为C端前体蛋白。利用N端前体蛋白带有的MBP标签可以与Amylose resin特异性结合,C端前体蛋白带有的6×组氨酸标签可以与Ni-NTA resin特异性结合,纯化得到用于后续体外反应所需的N端前体蛋白和C端前体蛋白。将纯化的N端前体蛋白与C端前体蛋白在摩尔比为1：1的条件下进行反应,通过Western印迹检测剪接反应的活性,结果表明,断裂蛋白质内含子SX-S1、TX-S1、SX-S11和TE3-S11在体外均有剪接活性。将N端前体蛋白和C端前体蛋白两两组合进行体外交叉反应,除TX-S1N/SX-S1C组合外,其它组合均无交叉反应,为同时使用多个断裂蛋白质内含子对一个目的蛋白进行多段标记或对多个目的蛋白进行标记奠定基础。在不同的DTT的浓度、温度、氯化钠的浓度和pH值条件下,探索断裂蛋白质内含子剪接的最优化条件,结果表明,除反应体系中无DTT存在时,剪接效率明显下降甚至无剪接反应发生以外,其余条件对剪接反应影响较小。当N端前体蛋白与C端前体蛋白摩尔比为10：1混合时,动力学分析实验结果表明,断裂蛋白质内含子SX-S1、TX-S1、SX-S11和TE3-S11体外剪接效率分别达到～96%、～50%、～93%和～87%,剪接速率常数分别为(2.68±0.39)×10-4 s-1、(2.19±0.33)×10-3 s-1、(3.94±0.91)×104 s-1和(3.43±0.59)×10-4 s-1。新型断裂蛋白质内含子在位点特异性蛋白标记的潜在应用,使蛋白质标记不再局限于传统的氨基酸特异性标记。新型断裂蛋白质内含子将在蛋白质工程、蛋白质药物开发和蛋白质结构与功能研究等方面有非常广泛的应用。

关键词：断裂蛋白质内含子反式剪接动力学体外反应