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拮抗芽孢杆菌的分离鉴定及其多样性和系统发育分析

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拮抗芽孢杆菌的分离鉴定及其多样性和系统发育分析

作者：刘芳南京农业大学

学位级别：硕士

已有研究者对中药源、乳酪、白酒糟醅、极端环境和土壤来源芽抱杆菌进行了分类和资源调查研究,但尚未有对拮抗芽孢杆菌进行分类和资源研究的报道。通过分类研究揭示拮抗芽抱杆菌的生物多样性及其系统发育地位,对深入发掘、保存及合理利... 详细信息

已有研究者对中药源、乳酪、白酒糟醅、极端环境和土壤来源芽抱杆菌进行了分类和资源调查研究,但尚未有对拮抗芽孢杆菌进行分类和资源研究的报道。通过分类研究揭示拮抗芽抱杆菌的生物多样性及其系统发育地位,对深入发掘、保存及合理利用芽孢杆菌种质资源有重要的理论价值和现实意义。本研究从中国江苏省、黑龙江省、海南省和新疆维吾尔自治区采集到不同生境土样28份,利用传统方法,分离鉴定到1593个芽孢杆菌,并从中筛选出了545个对植物病原真菌（Sclerotinia sclerotiorum）和病原细菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）有良好抑菌活性菌株。从各省区不同地区挑选具有良好抑菌活性的芽孢杆菌330个,运用ERIC-PCR扩增其基因间重复序列,对指纹图谱进行聚类分析,结果显示,在78%的相似度下各地区拮抗芽孢杆菌被分为若干群,最多的新疆阿克苏地区被分为16个群,最少的海南地区被分为10个群,说明拮抗芽孢杆菌在各地的分布具有很好的多样性。进一步分析数据发现,选出的拮抗菌大多数集中在解淀粉芽孢杆菌群（Bacillus amyloliquefaciens group）、枯草芽孢杆菌群（B. Subtilis group）、短小芽孢杆菌群（B. pumilus group）和巨大芽孢杆菌群（B. megatrium group）。对于不同省区的拮抗芽孢杆菌,南部主要以B. megatrium group为主,北部和西部主要以B. pumilus group为主,而东部由于分离菌株较少没有找到拮抗菌;同一省区新疆维吾尔自治区的不同地区,拮抗菌优势种群不一样,南疆地区B. amyloliquefaciens group分布较少,而北疆地区B. megatriumgroup分布较少。不同生境对于拮抗芽孢杆菌的分布没有特别影响。从330个具有良好抑菌活性的芽孢杆菌中,选取对病原真菌的抑菌圈达到25mm以上,对病原细菌的抑菌圈达到30mm以上的24株有较高抑菌活性的菌株,进行形态学,生理生化学测定,并扩增了其16S rRNA和gyrB基因序列,结合它们的ERIC-PCR指纹图谱聚类分析,我们发现,聚类分析结果与gyrB基因序列鉴定结果具有良好的一致性。以此说明利用ERIC-PCR旨纹图谱进行多样性分析具有可靠性。本研究同时还对西藏具有拮抗作用的菌株进行了低温适生菌筛选,结果找到2株（RJGP41和CJLC2）能在4℃下生长,25株能在10℃下生长良好的菌株,命名为低温适生芽孢杆菌。结合促拟南芥生长和促玉米种子萌发实验,我们找到菌株RJGP41,CJLC2, GBSC56和NMSL88有较好的促生长作用,且在低温下也能稳定促进玉米生长。经16S rDNA扩增测序,将它们分别鉴定到种：RJGP41属于B. simplex;CJLC2属于***;GBSC56属于B. atropheus;NMSL88属于***。对27个低温适生菌进行抗菌谱测定,结果显示LSSC3 （***）具有较强的抗菌作用,尤其对病原真菌。这些低温菌具有耐低温和促生、抗菌的双重作用,在农业生产上具有应用的潜力。

关键词：拮抗芽孢杆菌多样性 ERIC-PCR指纹图谱 16S rRNA和gyrB基因序列促生作用和促种子萌发低温适生芽孢杆菌

烟草青枯病拮抗芽孢杆菌的筛选、鉴定及其抑菌活性初探

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2014年第2期42卷 123-130页

作者：刘伟刘鹏沈小英安天赐成巨龙安德荣西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室陕西杨凌712100 吉林农业大学农学院吉林长春130118 中国烟草总公司陕西省烟草研究所陕西西安710061

【目的】从不同烟区健康烟草的根际土壤样品中筛选对烟草青枯病具有较强拮抗作用的芽孢杆菌,为防治烟草青枯病提供生防资源。【方法】随机从福建龙岩、四川德昌、陕西汉中等地健康烟草根际土壤中采集30份土壤样品,采用平板稀释法从中分... 详细信息

【目的】从不同烟区健康烟草的根际土壤样品中筛选对烟草青枯病具有较强拮抗作用的芽孢杆菌,为防治烟草青枯病提供生防资源。【方法】随机从福建龙岩、四川德昌、陕西汉中等地健康烟草根际土壤中采集30份土壤样品,采用平板稀释法从中分离芽孢杆菌,以烟草青枯病菌为靶标菌筛选拮抗芽孢杆菌,并通过培养特性、菌体形态、生理生化特征分析及16SrDNA序列分析,对筛选的拮抗芽孢杆菌菌株进行鉴定;采用温室盆栽试验,测定拮抗芽孢杆菌的促生作用、定殖能力和抑菌活性。【结果】从健康烟草根际土壤中分离得到1株抗烟草青枯病菌活性较好的菌株LW-4,经鉴定其为甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus。LW-4菌悬液对烟草青枯病菌的防治效果为70.37%,其可定殖于烟草根际土壤,具有良好的定殖能力。LW-4对烟草有明显的促生作用;用饱和度为25%的硫酸铵获得的LW-4抑菌物质对烟草青枯病菌的抑菌活性较高,抑菌圈直径达37.82mm。【结论】菌株LW-4在烟草青枯病防治中具有潜在的利用价值。

关键词：烟草青枯病拮抗芽孢杆菌定殖能力促生作用防治效果

番茄灰霉病拮抗芽孢杆菌LW-6-1的筛选、鉴定及抑菌活性研究

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2013年第11期41卷 73-79页

作者：刘伟宋双沈小英安天赐牛小义安德荣西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室陕西杨凌712100

【目的】从福建、四川、陕西等地耕作土壤中筛选对番茄灰霉病有较强生防效果的拮抗芽孢杆菌。【方法】随机采集福建、四川、陕西等地耕作土壤样品30份,采用平板稀释法从中分离芽孢杆菌,以番茄灰霉病菌、稻瘟病菌、辣椒疫霉病菌、苹果轮... 详细信息

【目的】从福建、四川、陕西等地耕作土壤中筛选对番茄灰霉病有较强生防效果的拮抗芽孢杆菌。【方法】随机采集福建、四川、陕西等地耕作土壤样品30份,采用平板稀释法从中分离芽孢杆菌,以番茄灰霉病菌、稻瘟病菌、辣椒疫霉病菌、苹果轮纹病菌、小麦根腐病菌、棉花枯萎病菌为靶标菌筛选拮抗芽孢杆菌;检测拮抗芽孢杆菌菌株无菌发酵液对供试病原真菌菌丝生长、孢子萌发、菌丝形态的影响;通过形态学特征、生理生化特征及16SrDNA序列分析,对筛选出的拮抗菌株进行鉴定。【结果】从采集的30份土壤样品中分离得到273株芽孢杆菌,经病原真菌定向筛选后,得到1株对番茄灰霉病菌、稻瘟病菌、辣椒疫霉病菌、苹果轮纹病菌、小麦根腐病菌、棉花枯萎病菌有较强生防效果的芽孢杆菌LW-6-1,LW-6-1菌株无菌发酵液对番茄灰霉病菌和稻瘟病菌菌丝生长的抑制效果较好,菌丝生长抑制率分别为95.34%和92.56%,EC50分别为10.18和10.84mL/L;对抑制番茄灰霉病菌和稻瘟病菌孢子萌发的抑制率分别为93.98%和92.09%,EC50分别为2.03和2.67mL/L。经鉴定,LW-6-1为甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus。【结论】筛选到的拮抗芽孢杆菌LW-6-1对番茄灰霉病有较强的生防效果,能显著抑制番茄灰霉病菌的生长。

关键词：番茄灰霉病拮抗芽孢杆菌生物防治甲基营养型芽孢杆菌

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我国水产拮抗芽孢杆菌的研究进展

食品科学 2012年第9期33卷 314-318页

作者：曹海鹏何珊王会聪刘丽玲吕利群上海海洋大学国家水生动物病原库上海201306 上海师范大学教育学院上海200234

拮抗芽孢杆菌是最有发展前景、可替代饲料抗生素添加剂的优良益生菌之一。如何促进拮抗芽孢杆菌在水产养殖中的应用是缓解抗生素滥用的一项重要课题。鉴于此,本文在介绍我国水产拮抗芽孢杆菌研究与应用现状的基础上,对我国水产拮抗芽孢... 详细信息

拮抗芽孢杆菌是最有发展前景、可替代饲料抗生素添加剂的优良益生菌之一。如何促进拮抗芽孢杆菌在水产养殖中的应用是缓解抗生素滥用的一项重要课题。鉴于此,本文在介绍我国水产拮抗芽孢杆菌研究与应用现状的基础上,对我国水产拮抗芽孢杆菌研究与应用中存在的问题进行剖析,并提出加强水产拮抗芽孢杆菌研究的建议。

关键词：拮抗芽孢杆菌研究进展应用前景

香蕉枯萎病拮抗芽孢杆菌脂肽类抗生素基因引物筛选

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分子植物育种 2020年第24期18卷 8196-8205页

作者：邓涛郭立佳杨腊英周游汪军柳志强黄俊生海南大学生命科学与药学院海口570228 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室海口571101

脂肽类抗生素(cyclic lipopeptides, CLPs)是芽孢杆菌产生的一类天然农用抗生素,在芽孢杆菌生物防治方面发挥着重要作用。本研究测定了包括解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌4种共20株芽孢杆菌对香蕉枯萎病等... 详细信息

脂肽类抗生素(cyclic lipopeptides, CLPs)是芽孢杆菌产生的一类天然农用抗生素,在芽孢杆菌生物防治方面发挥着重要作用。本研究测定了包括解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌4种共20株芽孢杆菌对香蕉枯萎病等病原真菌的拮抗能力。设计了包括Bacillomycin、Fengycins、Iturins、Surfactin等CLPs相关合成基因的引物,对供试20株芽孢杆菌及7份土壤样品进行PCR扩增,筛选出可用于对芽孢杆菌和土壤监测的CLPs引物。结果表明:共有16株芽孢杆菌表现出拮抗病原真菌的能力,显微观察到这些芽孢杆菌发酵液中的脂肽类粗提物能够破坏Foc4的生物膜系统及细胞壁,使菌丝膨胀畸形;获得12对可有效扩增芽孢杆菌CLPs基因的引物对(BamD-F/R, BamA-F/R, FenA-F/R, FenB-F/R, 61FenA-F/R,61FenB-F/R, ItuA-F/R, ItuB-F/R, ItuC-F/R, ItuD-F/R, SrfAA-F/R, SrfAB-F/R),供试芽孢杆菌中具有拮抗能力的芽孢杆菌均能扩增到ItuC基因,拮抗芽孢杆菌抑制病原菌的能力与脂肽类抗生素基因的多样性与丰富度存在正向联系;通过对土壤总DNA进行扩增,发现所设计的4对引物均能有效监测土壤环境中的芽孢杆菌的CLPs基因,这一方法可以作为常规涂板计数与高通量测序方法的重要补充。为进一步进行田间监测指导施用芽孢杆菌控制植物土传病害提供理论支持。

关键词：香蕉枯萎病拮抗芽孢杆菌脂肽类抗生素基因

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枸杞叶枯病拮抗芽孢杆菌的筛选、鉴定及防效

北方园艺 2019年第15期 23-29页

作者：刘伟何彩金娜李栋史星雲刘鹏武威市林业科学研究院甘肃武威733000 华中农业大学植物科学技术学院生物质与生物能源研究中心湖北武汉430070

为获得对枸杞叶枯病有较强拮抗作用的芽孢杆菌,从农田土壤中,分离、纯化得到151株芽孢杆菌,经病原真菌定向筛选得到1株对枸杞叶枯病菌拮抗活性较好的菌株LKYLW-1,其对枸杞叶枯病菌的抑菌带宽15.2 mm,采用平板对峙法、孢子萌发法和田间... 详细信息

为获得对枸杞叶枯病有较强拮抗作用的芽孢杆菌,从农田土壤中,分离、纯化得到151株芽孢杆菌,经病原真菌定向筛选得到1株对枸杞叶枯病菌拮抗活性较好的菌株LKYLW-1,其对枸杞叶枯病菌的抑菌带宽15.2 mm,采用平板对峙法、孢子萌发法和田间药效试验测定LKYLW-1的抑菌作用。结果表明:菌株LKYLW-1对枸杞叶枯病菌菌丝有致畸作用;菌株LKYLW-1发酵液对孢子萌发有抑制作用,EC50为9.35 mL·L-1;该菌株对枸杞叶枯病具有较好的治疗和预防效果。通过形态学特征、理化分析及16S rDNA序列分析对菌株LKYLW-1进行了鉴定,检测了其代谢产物,研究发现菌株LKYLW-1为萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus,其在代谢过程中可产生纤维素酶、蛋白酶和淀粉酶等抑菌物质;证明菌株LKYLW-1在枸杞叶枯病防治中具有潜在的利用价值。

关键词：枸杞叶枯病拮抗芽孢杆菌抑菌活性防治效果

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拮抗芽孢杆菌对蒙古黄芪主要药效成分的影响

中国农学通报 2021年第19期37卷 84-89页

作者：郭捷田海娇秦雪梅赵晓霞高芬山西省科技资源与大型仪器开放共享中心太原030006 山西大学中医药现代研究中心太原030006 山西大学应用化学研究所太原030006

探讨黄芪根腐病拮抗芽孢杆菌SXKF16-1(Bacillus atrophaeu)和SXKF16-2(B. methylotrophicus)对黄芪主要药效成分的影响,旨在为后续多功能制剂的开发提供依据。采用灌根法对健康黄芪苗浇注拮抗菌发酵液,HPLC-UV-ELSD法对10种药效成分进... 详细信息

探讨黄芪根腐病拮抗芽孢杆菌SXKF16-1(Bacillus atrophaeu)和SXKF16-2(B. methylotrophicus)对黄芪主要药效成分的影响,旨在为后续多功能制剂的开发提供依据。采用灌根法对健康黄芪苗浇注拮抗菌发酵液,HPLC-UV-ELSD法对10种药效成分进行测定。结果表明,毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、紫檀烷苷、异黄烷苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素和黄芪皂苷Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ在各自标准曲线相应的线性范围内线性关系良好(r≥0.9950),试验测定结果可靠。拮抗芽孢杆菌SXKF16-1和SXKF16-2处理对药效成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、紫檀烷苷、异黄烷苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅳ的含量均无明显影响,但显著促进黄芪皂苷Ⅰ和黄芪皂苷Ⅲ含量的升高。2组处理与对照相比,总黄酮含量均无明显变化,总皂苷含量显著升高。拮抗芽孢杆菌SXKF16-1和SXKF16-2对黄芪主要药效成分的含量无负面影响,可促进某些皂苷类成分的积累,具备开发为多功能制剂的潜力。

关键词：拮抗芽孢杆菌黄芪根腐病 HPLC-UV-ELSD 黄酮类皂苷类

烟草赤星病菌拮抗芽孢杆菌的筛选、鉴定及应用研究

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烟草赤星病菌拮抗芽孢杆菌的筛选、鉴定及应用研究

作者：马志远西北农林科技大学

学位级别：硕士

在我国，烟草作为重要的叶用经济作物，在农业生产中有着十分重要的作用。但是由于烟草病虫害的发生，每年都会带来巨大的经济损失，所以，在烟草种植过程中的各类病虫害防治工作也成为了农业工作者的研究重点。烟草赤星病作为烟草上的... 详细信息

在我国，烟草作为重要的叶用经济作物，在农业生产中有着十分重要的作用。但是由于烟草病虫害的发生，每年都会带来巨大的经济损失，所以，在烟草种植过程中的各类病虫害防治工作也成为了农业工作者的研究重点。烟草赤星病作为烟草上的主要病害之一，给我国的烟草生产带来巨大的经济损失。现阶段，用于烟草赤星病防治的方法很多，其中化学农药的防治是主要的防治手段，但是随着化学农药残留和环境污染等问题越来越受到关注，在烟草病害的防治过程中应该减少化学农药的使用，并贯彻“防治为主，综合防治”的方针，最具有研发应用潜质的是生物防治。芽孢杆菌是一类产芽孢、革兰氏染色呈阳性的细菌类群，自身具有营养简单、繁殖生长快、抗逆性强、代谢产物丰富，此外，其在自然界分布广泛，好氧或兼性厌氧、可产抗逆性芽孢。这些特点使其具有显著的生防潜力，并成为研发生防菌剂的理想菌株。本研究通过对烟草根际土壤和烟叶叶围的微生物资源进行定向的分离筛选以求获得对烟草赤星病有强拮抗活性的芽孢杆菌。本研究从陕西、云南、湖北和河南4省烟区采集烟草根际土壤和烟叶，从中分离筛选芽孢杆菌408株，进一步采用平板对峙法进行拮抗芽孢杆菌的筛选后得到获得10株有拮抗效果的芽孢杆菌，其中M-07菌株的拮抗效果最好。M-07菌株对烟草赤星病菌丝生长和孢子萌发有明显的抑制作用，抑菌条带宽度达到了14.2mm，通过连续10代的单孢分离培养及测定显示不同代数的M-07的拮抗活性较为稳定性。研究中通过对M-07菌体、菌落形态特征观察，生理生化特性并结合其16S rDNA序列分析，鉴定该M-07菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。M-07菌株在LB固体培养基上菌落表面有褶皱不光滑，边缘不规则，呈淡黄色，具有一定的黏性。在电镜下观察菌体呈杆状，有鞭毛，芽孢呈椭圆形，革兰氏阳性，可水解淀粉、明胶、酪朊、酪氨酸，利用葡萄糖产气，柠檬酸盐、V-P测定试验阳性等。本试验通过显微观察发现，M-07菌株使烟草赤星病病原真菌的菌丝生长出现畸形，菌丝体内部细胞原生质体分布不均匀，部分菌丝内原生质有流出并形成空壳的现象;在离体条件下采用生长速率法测得对烟草赤星病菌丝生长有抑制作用，EC50为12.82mg/L;活体条件下采用田间小区试验，测得当M-07菌株的粗提物质量浓度为80mg/L时，对烟草赤星病的防治效果达到86.0%。本论文对M-07菌株生理生化特性、16S rDNA测序、拮抗机理初探等研究所得到的各项结果进行总结，为生物防治烟草赤星病提供了一定的理论基础。

关键词：烟草赤星病拮抗芽孢杆菌 M-07 生物防治解淀粉芽孢杆菌

苹果树腐烂病病原菌的分离鉴定及其拮抗芽孢杆菌的筛选鉴定

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苹果树腐烂病病原菌的分离鉴定及其拮抗芽孢杆菌的筛选鉴定

作者：豆雅楠西北师范大学

学位级别：硕士

甘肃省作为黄土高原苹果生产的优势产区,同时也是北方苹果生产大省,但近年来,随着苹果种植产业结构的整改和栽培面积的增加,该病在各苹果产区普遍发生且有不断蔓延之势,已成为威胁我省苹果安全健康种植和可持续发展的主要制约因素。该... 详细信息

甘肃省作为黄土高原苹果生产的优势产区,同时也是北方苹果生产大省,但近年来,随着苹果种植产业结构的整改和栽培面积的增加,该病在各苹果产区普遍发生且有不断蔓延之势,已成为威胁我省苹果安全健康种植和可持续发展的主要制约因素。该病主要由Valsa mali Miyabe＆Yamada病菌引起,可侵染寄主的韧皮部和木质部而难以通过化学防治加以控制且常规杀菌剂疗效不佳,加之现有的苹果树品种极易受到病菌侵染,故该病不能通过抗病育种来加以控制。鉴于要减少杀菌剂处理所带来的环境污染问题,根据农业发展可持续原则,生物防治可认为是一种最为可取且高效有效的治疗方式。其中,由于芽孢杆菌具有极强的生态条件适应性,分布广泛,为土壤优势种,近几年备受青睐。本实验从甘肃省镇原县获得苹果树腐烂病的病株,对其通过组织分离法、离体枝条接种法进行病原菌的分离和致病性测定。以采自敦煌地区盐碱土壤中获得的芽孢杆菌对其开展生物防治实验。通过抗菌筛选实验得到对于苹果树腐烂病菌具有较强生防效果的芽孢杆菌,并对其做进一步的研究,包括芽孢杆菌的培养条件优化、抑菌广谱性测定、离体生防效果的检测等,力求找到防治苹果树腐烂病的新方法。主要研究结果如下:（1）采用组织分离法和离体枝条接种法获得苹果树腐烂病的致病菌,通过培养形态观察、显微特征鉴定及r DNA-ITS序列分析综合鉴定其为Valsa mali;（2）采用平板对峙培养法和菌丝生长速率法,对从敦煌地区盐碱土壤中分离的289株芽孢杆菌开展拮抗菌的筛选。经初筛,在供试的289株芽孢杆菌中筛选得到了21株抑菌率大于85%的芽孢杆菌,占芽孢杆菌总数的7.27%。采用菌丝生长速率法对得到的21株芽孢杆菌进行复筛,获得了一株对Valsa mali的菌丝生长有较好抑制作用的菌株7-2-1-2,用于后续研究;（3）对优良拮抗效果菌株7-2-1-2结合培养特征、生理生化及16S r DNA序列分析进行菌种鉴定,经鉴定,菌株7-2-1-2枯草芽孢杆菌亚种（Bacillus subtilis ***）;（4）对菌株7-2-1-2的进一步研究表明,该菌在NA培养基、28℃、150 r/min的培养条件以及1%接种量的条件下,只需要2个小时其细胞数就可以几何级数增加;抑菌广谱性测定结果显示该菌对供试的4种病原菌即马铃薯茄链格孢菌（Alternaria solani）、茄腐镰刀菌（Fusarium solani）、尖孢镰刀菌（Fusariumxoysporum）、油菜立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）均具有较好的抑菌作用,且抑菌率均在60%以上;（5）菌株7-2-1-2代谢产物对苹果树腐烂病菌的生防效果测定发现随着对发酵滤液稀释程度的增加,对苹果树腐烂病菌菌丝的抑制率随之减小;菌株7-2-1-2对苹果树腐烂病离体枝条防效结果表明:加入原液的离体枝条的防治效果约为93.53%且不同稀释倍数的菌株7-2-1-2发酵滤液对苹果树腐烂病菌的抑制作用存在差异

关键词：苹果树腐烂病盐碱土壤拮抗芽孢杆菌分类鉴定抑菌活性离体防效