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ZFP36互作蛋白基因OsGRP1的克隆及其在ABA诱导的抗氧化防护途径中的功能分析

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南京农业大学学报 2021年第6期44卷 1097-1106页

作者：陆秋萍季锷蒋明义南京农业大学生命科学学院江苏南京210095

[目的]本文通过对水稻甘氨酸富集基因OsGRP1的研究,从分子角度及生理遗传角度分析其在ABA诱导的抗氧化防护中的作用,并探究OsGRP1是否影响植物抗氧化防护与植物细胞壁发育。[方法]克隆基因分别构建相应重组质粒,用酵母双杂交试验(yeast ... 详细信息

[目的]本文通过对水稻甘氨酸富集基因OsGRP1的研究,从分子角度及生理遗传角度分析其在ABA诱导的抗氧化防护中的作用,并探究OsGRP1是否影响植物抗氧化防护与植物细胞壁发育。[方法]克隆基因分别构建相应重组质粒,用酵母双杂交试验(yeast two-hybrid,Y2H)研究转录因子ZFP36是否与OsGRP1蛋白水平互作,并通过GST pull-down(glutamine-S-transferase pull-down)、免疫共沉淀Co-IP(coimmunop-recipitation)、双分子荧光互补试验(bimolrcular fluorescence complementation,BiFC)辅证互作的真实性。观察ABA和H_(2)O_(2)条件下不同时间处理野生型水稻幼苗后OsGRP1转录水平表达的变化情况,鉴定OsGRP1转基因材料并测定突变体中与抗氧化防护相关的CAT和SOD活性及OsCatB基因和OsSodCc2基因的表达量,利用遗传材料分析在干旱和氧化胁迫下的耐逆性。[结果]OsGRP1基因的CDS序列为642 bp,编码214个氨基酸。通过Y2H、GST pull-down、Co-IP、BiFC证实OsGRP1与ZFP36互作的真实性。ABA和H_(2)O_(2)等处理均可诱导OsGRP1基因的表达上调。超表达OsGRP1基因可以提高抗氧化防护酶CAT和SOD活性及诱导OsCatB和OsSodCc2基因上调表达,并且OsGRP1-OE水稻在干旱和氧化胁迫下的存活率明显高于野生型水稻,而OsGRP1-KO水稻在干旱和氧化胁迫下的存活率明显低于野生型水稻,证明超表达OsGRP1基因增强了水稻对干旱胁迫和氧化胁迫的耐受性。[结论]OsGRP1参与ABA诱导的抗氧化防护途径并增强了水稻对干旱和氧化胁迫的耐性。

关键词：水稻 OsGRP1 蛋白相互作用抗氧化防护逆境胁迫

低氧环境下poly I:C刺激对淇河鲫肝胰脏抗氧化防护的影响

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水产学报 2016年第12期40卷 1830-1841页

作者：赵燕静狄桂兰孔祥会张杰李莉聂国兴李学军河南师范大学水产学院

明确低氧环境下poly I:C刺激对淇河鲫抗氧化水平的影响,对于理解低氧环境下鱼类对病原类似物的应激反应及免疫能力具有重要的意义。本实验选择体质量为(23±2)g,体长为(11±1)cm的健康淇河鲫,不同溶解氧含量[(1.0±0.2)、(2.0±0.2)、(... 详细信息

明确低氧环境下poly I:C刺激对淇河鲫抗氧化水平的影响,对于理解低氧环境下鱼类对病原类似物的应激反应及免疫能力具有重要的意义。本实验选择体质量为(23±2)g,体长为(11±1)cm的健康淇河鲫,不同溶解氧含量[(1.0±0.2)、(2.0±0.2)、(4.0±0.2)和(6.0±0.2)mg/L)]下饲养7 d后,实验组每尾鱼腹腔注射2 mg/m L poly I:C 100μL,对照组每尾注射0.75%Na Cl溶液100μL,分别在注射后12、24、48、96和168 h时测定肝胰脏超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性;分析Cu/ZnSOD、Mn-SOD、CAT和GPx基因的m RNA表达变化,同时检测丙二醛(MDA)含量。结果显示,低氧暴露7 d后,亚低氧水平(DO 4 mg/L)时淇河鲫肝胰脏抗氧化酶活性和m RNA表达量均显著高于正常溶氧组6 mg/L,说明在亚低氧条件下,淇河鲫通过抗氧化酶活性增加,在一定程度上降低了低氧的不利影响。低氧(DO 1和2 mg/L)时,抗氧化酶活性和m RNA表达量均显著低于6 mg/L,显示低氧条件下淇河鲫肝胰脏抗氧化防护能力降低,脂质过氧化产物MDA含量随着溶解氧含量的降低而升高。低氧环境下利用poly I:C刺激鱼体,抗氧化酶活性和m RNA表达量在48、96和168 h时显著低于对照组,显示低氧环境下病原类似物poly I:C刺激进一步加剧了鱼体抗氧化防护能力的下降,从而导致严重的氧化应激胁迫。注射poly I:C后MDA的含量显著高于对照组,说明低氧条件下注射poly I:C加剧了淇河鲫肝胰脏氧化应激程度。研究表明,低氧环境下鱼类抗氧化防护能力下降,产生氧化应激胁迫;低氧环境下病原类似物poly I:C刺激可加剧鱼体抗氧化防护水平的下降,从而减弱对外界病原的防御能力。

关键词：淇河鲫低氧 poly I:C 氧化应激抗氧化防护

番茄幼苗血红素加氧酶-1对热激的响应及其抗氧化防护作用

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植物生理学报 2015年第10期51卷 1640-1648页

作者：陈笑玥张毅华张耀文沈文飚南京农业大学生命科学学院南京210095 山西省农业科学院作物科学研究所太原030031

植物受到高温胁迫以后,会通过诱导热激响应(HSR)包括诱导热激蛋白(HSP)和抗氧化酶编码基因的表达来缓解胁迫造成的伤害,但是不清楚其具体的诱导机理。本实验以番茄(Solanum lycopersicum)‘苏红2003’幼苗为材料,研究了血红素加氧酶-1(H... 详细信息

植物受到高温胁迫以后,会通过诱导热激响应(HSR)包括诱导热激蛋白(HSP)和抗氧化酶编码基因的表达来缓解胁迫造成的伤害,但是不清楚其具体的诱导机理。本实验以番茄(Solanum lycopersicum)‘苏红2003’幼苗为材料,研究了血红素加氧酶-1(HO-1,EC 1.***.99.3)对热激的响应及其抗氧化防护作用。结果表明,45℃热激3 h内不但能以时间依赖性的方式诱导番茄幼苗脂质过氧化和抑制茎生长,还能上调HO的活性和HO-1蛋白水平;进一步加入HO-1的活性抑制剂锌原卟啉IX(Zn PPIX)则加剧热激诱导的氧化胁迫;此外,Zn PPIX还能部分阻断热激诱导的HO活性上调,同时热激诱导的两种抗氧化酶——过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性明显受到抑制,编码热激蛋白的Sl HSP70和Sl HSP20基因表达也被显著削弱或延迟,但Sl HSP17.7和Sl HSP101的转录本则不受Zn PPIX的影响。以上的研究结果表明,番茄HO-1能够部分参与HSP的诱导和抗氧化防护。

关键词：血红素加氧酶-1 热激抗氧化防护番茄

蛋白激酶组在玉米叶片ABA和H_2O_2诱导抗氧化防护中的作用(英文)

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植物分类与资源学报 2011年第3期33卷 275-286页

作者：许树成祝雪兰张丽阜阳师范学院生命科学学院安徽阜阳236041 安徽阜阳市红旗中学安徽阜阳236034 安徽省金寨县南溪中学安徽六安237321

蛋白磷酸化在植物细胞脱落酸(ABA)介导的信号转导中起重要作用。然而,很多参与ABA信号途径的蛋白元件仍不清楚。使用改进的体外激酶试验方法的研究结果表明,在玉米叶片中,ABA和H2O2能够快速活化蛋白激酶总活性和Ca2+依赖型蛋白激酶总活... 详细信息

蛋白磷酸化在植物细胞脱落酸(ABA)介导的信号转导中起重要作用。然而,很多参与ABA信号途径的蛋白元件仍不清楚。使用改进的体外激酶试验方法的研究结果表明,在玉米叶片中,ABA和H2O2能够快速活化蛋白激酶总活性和Ca2+依赖型蛋白激酶总活性;ABA诱导的蛋白激酶总活性增加可以被活性氧的抑制剂和清除剂抑制,蛋白激酶抑制剂不仅可以降低ABA和H2O2诱导的激酶活性增加,而且也可以弱化它们对抗氧化防护酶活性的诱导作用;ABA和H2O2引发的蛋白磷酸化作用显著居先于它们诱导的抗氧化防护作用。使用凝胶激酶试验方法进行研究发现,一组分子量分别为66kDa,52kDa,49kDa和35kDa的蛋白激酶可能介导了ABA和H2O2诱导的抗氧化防护反应,并且66kDa和49kDa的蛋白激酶可能在ROS的下游起作用,而52kDa和35kDa的蛋白激酶可能在ABA和ROS的下游起作用。

关键词： ABA 蛋白激酶磷酸化作用活性氧抗氧化防护

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ABA在植物细胞抗氧化防护过程中的作用

中国农业大学学报 2008年第2期13卷 11-19页

作者：许树成丁海东鲁锐石犇马芳芳阜阳师范学院生命科学学院安徽阜阳236032 南京农业大学生命科学学院南京210095

水分胁迫是一种影响植物生长发育、限制作物产量的重要环境因子,植物激素脱落酸(ABA)在调节植物对水分胁迫响应的过程中起重要作用。ABA不仅可以通过诱导气孔关闭来调节植物水分代谢,而且可以通过诱导脱水耐性蛋白的表达来增强植株对水... 详细信息

水分胁迫是一种影响植物生长发育、限制作物产量的重要环境因子,植物激素脱落酸(ABA)在调节植物对水分胁迫响应的过程中起重要作用。ABA不仅可以通过诱导气孔关闭来调节植物水分代谢,而且可以通过诱导脱水耐性蛋白的表达来增强植株对水分胁迫的抗性。越来越多的证据表明,ABA增强水分胁迫耐性的作用与其诱导的抗氧化防护系统有关。本文综述了ABA诱导活性氧产生、抗氧化防护酶基因表达、抗氧化防护酶活性增强方面的新进展,进一步分析了NADPH氧化酶、激酶磷酸化反应、Ca2+与活性氧之间的"交谈"在ABA诱导的抗氧化防护反应中的作用,认为:ABA诱导的抗氧化作用在植物细胞内的信号转导途径是网络,而不是直线通路,蛋白激酶磷酸化反应是H2O2传递信号的主要方式。

关键词：脱落酸(ABA) 抗氧化防护活性氧(ROS) 信号转导水分胁迫

NO介导ABA诱导的玉米叶片叶绿体和质外体的抗氧化防护

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南京农业大学学报 2006年第4期29卷 33-37页

作者：许可飞蒋明义谭明谱南京农业大学生命科学学院江苏南京210095

用硝普钠(SNP,NO供体)和ABA处理玉米幼苗,结果显示,ABA和SNP均增强了玉米叶片中抗氧化酶SOD、CAT、GR和APX的活性;激光共聚焦显微检测显示,ABA能够诱导叶片中NO的合成;NO清除剂PTIO和合成抑制剂L-NAME预处理阻断了ABA诱导的抗氧化酶活... 详细信息

用硝普钠(SNP,NO供体)和ABA处理玉米幼苗,结果显示,ABA和SNP均增强了玉米叶片中抗氧化酶SOD、CAT、GR和APX的活性;激光共聚焦显微检测显示,ABA能够诱导叶片中NO的合成;NO清除剂PTIO和合成抑制剂L-NAME预处理阻断了ABA诱导的抗氧化酶活性的上升及NO的合成。对不同亚细胞区室的研究显示,ABA和NO对质外体和叶绿体中的抗氧化酶系统均表现出诱导效应,而PTIO和L-NAME阻断了这种诱导。上述结果表明,在玉米叶片中,NO介导了ABA的信号转导,诱导叶绿体和质外体中的抗氧化酶系统协同作用,共同提高了叶片的抗氧化防护能力。

关键词： ABA NO 抗氧化防护叶绿体质外体

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淡水鱼类对低氧的抗氧化防护响应

水产科学 2016年第5期35卷 591-596页

作者：赵燕静狄桂兰蒋昕彧李慧孔祥会河南师范大学水产学院河南省水产动物养殖工程技术研究中心水产动物疾病控制河南省工程实验室河南新乡453007

氧气对需氧生物的生存至关重要。同一分压下,水中氧含量仅为陆地空气氧含量的1/30,水生脊椎动物氧的可利用性比陆生动物更重要。此外,氧气在水中的扩散速度只有空气中的1/10 000[1]。所以,无论是生物或非生物过程中引起氧的可利用性或... 详细信息

氧气对需氧生物的生存至关重要。同一分压下,水中氧含量仅为陆地空气氧含量的1/30,水生脊椎动物氧的可利用性比陆生动物更重要。此外,氧气在水中的扩散速度只有空气中的1/10 000[1]。所以,无论是生物或非生物过程中引起氧的可利用性或氧消耗变化,均显著影响水环境中溶解氧的含量变化。因此,大多数海洋、河口和淡水较容易发生连续或慢性的低氧现象。

关键词：低氧淡水鱼类氧化应激抗氧化防护

水稻OsGRP与ZFP36互作的鉴定及其在ABA诱导的抗氧化防护中的作用研究

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水稻OsGRP与ZFP36互作的鉴定及其在ABA诱导的抗氧化防护中的作用...

作者：陆秋萍南京农业大学

学位级别：硕士

当植物遭遇干旱,盐等非生物胁迫时,体内会迅速积累脱落酸（Abscisic acid,ABA）。ABA作为一种信号分子,通过调节植物体中的抗氧化防护系统活性,提高其对干旱的耐受性。植物锌指蛋白（Zinc Finger Proteins,ZFPs）是一类重要的转录因子,... 详细信息

当植物遭遇干旱,盐等非生物胁迫时,体内会迅速积累脱落酸（Abscisic acid,ABA）。ABA作为一种信号分子,通过调节植物体中的抗氧化防护系统活性,提高其对干旱的耐受性。植物锌指蛋白（Zinc Finger Proteins,ZFPs）是一类重要的转录因子,实验室前期研究已经证明锌指蛋白ZFP36参与水稻中ABA诱导的抗氧化防护途径,并利用酵母双杂交实验（Yeast two-hybrid,Y2H）,以ZFP36为诱饵,筛选水稻叶片c DNA文库,鉴定出一个可能与ZFP36相互作用的蛋白-甘氨酸富集蛋白（OsGRP）。OsGRP是以（Gly-X）n重复序列的形式存在,甘氨酸含量高,这一特征决定了GRP参与许多重要的细胞信号转导过程。关于OsGRP是否参与ABA介导的抗氧化防护途径还尚不清楚,所以本文对此进行了以下研究:由于酵母双杂交存在假阳性的可能,所以通过Y2H进行回复验证互作的真实性。并利用GST pull-down（Glutamine-S-Transferase pull-down）、萤火虫荧光素酶成像系统（Luciferase Complementation Imaging,LCI）、免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）和双分子荧光互补实验（Bimolrcular Fluorescence Complementation,Bi FC）证实OsGRP与ZFP36在体外和体内存在相互作用。为了确定OsGRP在细胞中的具体定位,通过水稻原生质体对OsGRP进行亚细胞定位,观察发现OsGRP定位于细胞核、细胞质和细胞膜。有研究发现OsGRP是一种细胞壁前体蛋白,为了确定OsGRP是否定位于细胞壁,通过烟草叶片、洋葱表皮细胞对其进行亚细胞定位,同时利用洋葱表皮细胞质壁分离实验证实OsGRP只定位于细胞核、细胞质和细胞膜,不定位于细胞壁。前期研究表明ZFP36定位于细胞核,OsGRP和ZFP36在细胞核中重叠,这在空间上证明OsGRP与ZFP36存在相互作用的可能性。用ABA、HO、聚乙二醇（PEG）和Na Cl分别对水稻三叶期幼苗进行处理,通过实时荧光定量PCR分析OsGRP基因表达的变化,实验结果表明ABA、HO、PEG和Na Cl均可诱导OsGRP表达上调。ABA处理20 min和240 min时OsGRP表达出现峰值。进一步使用HO清除剂（二甲基硫脲,DMTU）和抑制剂（二苯基氯化碘,DPI）预处理水稻后发现ABA通过诱导内源HO诱导OsGRP的表达。为了进一步验证OsGRP在ABA介导的抗氧化防护途径中的作用,我们构建了OsGRP转基因水稻。利用OsGRP转基因水稻和ZFP36转基因水稻（实验室已有材料）,通过RT-q PCR分析发现ABA信号转导中OsGRP基因位于ZFP36基因的下游。同时利用OsGRP转基因水稻发现过表达OsGRP基因可以诱导抗氧化防护酶CAT、SOD酶活性和相关基因OsCat B、OsSod Cc2表达的提高。用PEG和HO对OsGRP转基因水稻三叶期幼苗进行处理,发现OsGRP-OE水稻幼苗的耐旱性和抗氧化性要显著高于野生型水稻幼苗;osgrp-KO水稻幼苗的耐旱性和抗氧化性要显著低于野生型水稻幼苗。这表明OsGRP基因提高了水稻对干旱和氧化胁迫的耐性。本文鉴定了一个ZFP36在ABA信号途径中的互作蛋白OsGRP,明确了OsGRP与ZFP36的互作发生在细胞核中,揭示了OsGRP基因位于ZFP36基因的下游,受ZFP36的调控。证实过表达OsGRP基因可以诱导抗氧化防护酶CAT、SOD酶活性和相关基因OsCat B、OsSod Cc2表达的提高。利用转基因材料证明过表达OsGRP基因可以提高水稻的耐旱性和抗氧化性。以上结果显示OsGRP介导水稻中ABA诱导的抗氧化防护过程,这一结果为该蛋白在抗氧化防护方面的研究提供了新思路。

关键词：水稻 ABA OsGRP ZFP36 蛋白互作抗氧化防护

参与ABA诱导抗氧化防护信号转导的OsDMI3互作蛋白的鉴定

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参与ABA诱导抗氧化防护信号转导的OsDMI3互作蛋白的鉴定

作者：李溪南京农业大学

学位级别：硕士

ABA(absicsicacid)是一种经典的植物激素,调节植物体内多种生理过程,并在植物响应环境胁迫中起着重要的作用。Ca2+作为ABA信号转导途径中重要的第二信使,需要与受体蛋白结合将信号传递至下游,而CaM作为植物中重要的Ca2+受体蛋白其本身... 详细信息

ABA(absicsicacid)是一种经典的植物激素,调节植物体内多种生理过程,并在植物响应环境胁迫中起着重要的作用。Ca2+作为ABA信号转导途径中重要的第二信使,需要与受体蛋白结合将信号传递至下游,而CaM作为植物中重要的Ca2+受体蛋白其本身并不具有活性,其介导的信号通路及相关生理反应均通过钙调素结合蛋白(CaMBPs)来实现。CaMBPs成员之一的Ca2+/CaM依赖型蛋白激酶(CCaMK)已经被证实是脱落酸(ABA)信号转导中的一个重要组分。水稻中OsDMI3(CCaMK)被证实参与ABA诱导抗氧化防护途径。然而OsDMI3在这一过程中的作用机制仍有待阐明。阐明ABA信号途径中OsDMI3互作蛋白对于阐明CCaMK在植物应答胁迫反应中的作用机制是十分重要的。本实验前期以OsDMI3为诱饵,利用酵母双杂筛选水稻叶片cDNA文库,筛选出多个与OsDMI3互作的蛋白。酵母双杂交系统存在较高的假阳性,因此本文调查三个筛选出的OsDMI3互作蛋白OsUGD,OsBIP130,OsRab5a与OsDMI3互作的真实性,以及其在ABA诱导的抗氧化防护中的作用,主要结果如下:通过双分子荧光互补(BiFC)、免疫共沉淀(CoIP)、GST-pulldown实验验证了OsDMI3与OsUGD、OsRab5A确实存在相互作用,通过BiFC与CoIP实验验证了 OsDMI3与OsBIP130互作的真实性;检测ABA处理的水稻中Os UGD,OsBIP130,OsRab5a基因的表达,发现OsUGD表达量在外源ABA处理60min时出现峰值,OsBIP130表达量在30min和90min时出现双峰,OsRab5A表达量在30min时出现峰值。利用原生质体瞬时表达体系,瞬时干扰OsUGD和OsBIP130,发现OsUGD和OsBIP130瞬时沉默均能阻碍ABA信号中的抗氧化防护酶SOD和CAT的酶活性的上升。说明OsUGD和OsBIP130可能参与了 ABA诱导的抗氧化防护途径。而瞬时沉默OsRab5A并不十分明显的影响ABA信号途径中SOD和CAT的酶活性的变化。说明OsRab5A可能不参与ABA诱导的抗氧化防护途径。本文验证了 OsDMI3与靶蛋白OsUGD、OsBIP130和OsRab5A相互作用的真实性,并确定水稻叶片中OsUGD,OsBIP130和OsRab5A均受ABA诱导上调。利用水稻原生质体瞬时沉默体系,发现OsUGD、OsBIP130参与ABA诱导的抗氧化防护途径,而OsRab5A可能并不参与其中。这一系列的工作为进一步鉴定ABA信号途径中OsDMI3下游靶蛋白并阐明相关信号通路奠定了基础。

关键词： ABA OsDMI3 OsUGD OsBIP130 OsRab5A 抗氧化防护