水稻OsGRP与ZFP36互作的鉴定及其在ABA诱导的抗氧化防护中的作用研究

作     者：陆秋萍 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：蒋明义

授予年度：2021年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：水稻 ABA OsGRP ZFP36 蛋白互作 抗氧化防护 

摘      要：当植物遭遇干旱,盐等非生物胁迫时,体内会迅速积累脱落酸（Abscisic acid,ABA）。ABA作为一种信号分子,通过调节植物体中的抗氧化防护系统活性,提高其对干旱的耐受性。植物锌指蛋白（Zinc Finger Proteins,ZFPs）是一类重要的转录因子,实验室前期研究已经证明锌指蛋白ZFP36参与水稻中ABA诱导的抗氧化防护途径,并利用酵母双杂交实验（Yeast two-hybrid,Y2H）,以ZFP36为诱饵,筛选水稻叶片c DNA文库,鉴定出一个可能与ZFP36相互作用的蛋白-甘氨酸富集蛋白（OsGRP）。OsGRP是以（Gly-X）n重复序列的形式存在,甘氨酸含量高,这一特征决定了GRP参与许多重要的细胞信号转导过程。关于OsGRP是否参与ABA介导的抗氧化防护途径还尚不清楚,所以本文对此进行了以下研究:由于酵母双杂交存在假阳性的可能,所以通过Y2H进行回复验证互作的真实性。并利用GST pull-down（Glutamine-S-Transferase pull-down）、萤火虫荧光素酶成像系统（Luciferase Complementation Imaging,LCI）、免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）和双分子荧光互补实验（Bimolrcular Fluorescence Complementation,Bi FC）证实OsGRP与ZFP36在体外和体内存在相互作用。为了确定OsGRP在细胞中的具体定位,通过水稻原生质体对OsGRP进行亚细胞定位,观察发现OsGRP定位于细胞核、细胞质和细胞膜。有研究发现OsGRP是一种细胞壁前体蛋白,为了确定OsGRP是否定位于细胞壁,通过烟草叶片、洋葱表皮细胞对其进行亚细胞定位,同时利用洋葱表皮细胞质壁分离实验证实OsGRP只定位于细胞核、细胞质和细胞膜,不定位于细胞壁。前期研究表明ZFP36定位于细胞核,OsGRP和ZFP36在细胞核中重叠,这在空间上证明OsGRP与ZFP36存在相互作用的可能性。用ABA、HO、聚乙二醇（PEG）和Na Cl分别对水稻三叶期幼苗进行处理,通过实时荧光定量PCR分析OsGRP基因表达的变化,实验结果表明ABA、HO、PEG和Na Cl均可诱导OsGRP表达上调。ABA处理20 min和240 min时OsGRP表达出现峰值。进一步使用HO清除剂（二甲基硫脲,DMTU）和抑制剂（二苯基氯化碘,DPI）预处理水稻后发现ABA通过诱导内源HO诱导OsGRP的表达。为了进一步验证OsGRP在ABA介导的抗氧化防护途径中的作用,我们构建了OsGRP转基因水稻。利用OsGRP转基因水稻和ZFP36转基因水稻（实验室已有材料）,通过RT-q PCR分析发现ABA信号转导中OsGRP基因位于ZFP36基因的下游。同时利用OsGRP转基因水稻发现过表达OsGRP基因可以诱导抗氧化防护酶CAT、SOD酶活性和相关基因OsCat B、OsSod Cc2表达的提高。用PEG和HO对OsGRP转基因水稻三叶期幼苗进行处理,发现OsGRP-OE水稻幼苗的耐旱性和抗氧化性要显著高于野生型水稻幼苗;osgrp-KO水稻幼苗的耐旱性和抗氧化性要显著低于野生型水稻幼苗。这表明OsGRP基因提高了水稻对干旱和氧化胁迫的耐性。本文鉴定了一个ZFP36在ABA信号途径中的互作蛋白OsGRP,明确了OsGRP与ZFP36的互作发生在细胞核中,揭示了OsGRP基因位于ZFP36基因的下游,受ZFP36的调控。证实过表达OsGRP基因可以诱导抗氧化防护酶CAT、SOD酶活性和相关基因OsCat B、OsSod Cc2表达的提高。利用转基因材料证明过表达OsGRP基因可以提高水稻的耐旱性和抗氧化性。以上结果显示OsGRP介导水稻中ABA诱导的抗氧化防护过程,这一结果为该蛋白在抗氧化防护方面的研究提供了新思路。