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2023年江苏常州地区H9N2亚型禽流感病毒遗传演化与抗原性分析

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中国家禽 2024年

作者：李玉冬张海涛罗燕周勇董金泽陈洪壮束思成陈雪张双玉刘晓妹杨亚军李荣杰夏福芳蒲娟罗坚强 1.中国农业大学动物医学院 2.兽医公共卫生安全全国重点实验室 3.农业农村部禽流感等家禽重大疾病防控重点实验室 4.江苏立华牧业股份有限公司 5.常州市动物疫病预防控制中心中国农业大学动物医学院兽医公共卫生安全全国重点实验室农业农村部禽流感等家禽重大疾病防控重点实验室江苏立华牧业股份有限公司常州市动物疫病预防控制中心

试验旨在调查H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）在江苏省常州市的流行情况。2023年3—12月，在常州市所有辖区的交易平台、散养户、活禽市场、屠宰场等7种场所类型的147个采样场点开展H9N2亚型AIV流行病学调查，试验采... 详细信息

试验旨在调查H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）在江苏省常州市的流行情况。2023年3—12月，在常州市所有辖区的交易平台、散养户、活禽市场、屠宰场等7种场所类型的147个采样场点开展H9N2亚型AIV流行病学调查，试验采集鸡、鸭、鹅、鸽等咽拭子、组织样品以及环境拭子共计1 970份，进行AIV分离及其流行病学特征分析，并对分离的H9N2亚型AIV进行遗传演化、关键氨基酸与糖基化位点和抗原性分析。结果显示：共鉴定出73株H9N2亚型AIV，平均分离率为3.70%;4月和5月分离率较高，分别为7.07%和8.00%；分离地点中活禽市场和交易平台的分离率最高；H9N2亚型AIV在鸡、鸭、鸽、野鸟粪便和环境中均有分离，在环境和鸡中的分离率最高，分别为6.90%和4.15%；分离的H9N2亚型AIV属于欧亚谱系9.1分支中Group 2群，与2021—2023年多个地区人感染H9N2亚型AIV亲缘关系较近；与参考株序列相比，H9N2亚型AIV分离株HA蛋白的130-loop、150-loop及190-helix存在明显氨基酸多态性，但没有发现新的糖基化位点；H9N2亚型AIV分离株均属于当前优势流行的抗原群，尚未发生明显抗原漂移。综上所述，江苏常州地区H9N2亚型AIV流行的热点场所是活禽市场和交易平台，提示环境消毒是控制病毒传播和污染的关键手段；H9N2亚型AIV可能在野生禽类中流行，须减少家禽与野禽接触；并且H9N2亚型AIV分离株HA蛋白受体结构域变异可能对人间感染造成持续威胁，值得关注。

关键词： H9N2亚型禽流感活禽市场遗传演化抗原性江苏

4株不同基因型新城疫病毒毒力测定及与商品疫苗株抗原性比较

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动物医学进展 2024年第2期45卷 16-21页

作者：黄青红华俊谢丽基谢芝勋曾婷婷李孟罗思思李丹谢志勤广西大学动物科学技术学院广西南宁530001 广西壮族自治区兽医研究所农业农村部中国(广西)-东盟跨境动物疫病防控重点实验室广西兽医生物技术重点实验室广西南宁530001

为了探究不同基因型和不同来源4株新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)及现有商品疫苗株的抗原性差异,测定4株新城疫病毒的鸡胚最小致死量的平均死亡时间(mean death time,MDT)和1日龄雏鸡脑内接种致病指数(intracerebral pathogen... 详细信息

为了探究不同基因型和不同来源4株新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)及现有商品疫苗株的抗原性差异,测定4株新城疫病毒的鸡胚最小致死量的平均死亡时间(mean death time,MDT)和1日龄雏鸡脑内接种致病指数(intracerebral pathogenicity index,ICPI),分别制备油乳苗,再与商品疫苗NDV La Sota株、A-Ⅶ株分别接种SPF鸡,收集单因子血清进行HI交叉试验和细胞交叉中和试验。结果显示,基因Ⅵ型NDV B27为中等毒力毒株,基因Ⅶ型NDV B9、基因Ⅸ型NDV B14、基因Ⅻ型NDV GX01为强毒株;HI交叉试验结果显示,基因Ⅵ型NDV B27和基因Ⅸ型NDV B14抗原同源性为0.64,抗原性差异微小,其他毒株之间的抗原同源性为0.69~0.99,抗原差异不大;细胞交叉中和试验结果显示,基因Ⅵ型NDV B27和基因Ⅸ型NDV B14抗原同源性为0.42,基因Ⅵ型NDV B27和基因Ⅱ型疫苗株La Sota抗原同源性为0.47,抗原差异较大,其余毒株及疫苗株La Sota之间抗原差异微小。试验结果可为后续筛选NDV疫苗候选株提供参考。

关键词：新城疫病毒基因型抗原性致病指数

非洲猪瘟病毒CD2v蛋白胞内域与胞外域的原核表达及其抗原性分析

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中国畜牧兽医 2024年第4期51卷 1660-1670页

作者：李艳蕊任静崔锦蔷袁晨王云霄马亚娟刘志昌李永社宋勤叶河北农业大学动物医学院河北省兽医生物技术创新中心保定071000 保定市动物疫病预防控制中心保定071051 邯郸市永年区兽医院邯郸057150

【目的】应用大肠杆菌表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)CD2v蛋白胞外域(N-端,CD2v-N)与胞内域(C-端,CD2v-C)并分析两者的抗原性,为ASFV检测方法的研发提供试验依据和指导。【方法】构建CD2v-N和CD2v-C的重组... 详细信息

【目的】应用大肠杆菌表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)CD2v蛋白胞外域(N-端,CD2v-N)与胞内域(C-端,CD2v-C)并分析两者的抗原性,为ASFV检测方法的研发提供试验依据和指导。【方法】构建CD2v-N和CD2v-C的重组原核表达质粒,在体外表达并纯化CD2v-N和CD2v-C蛋白,通过Western blotting对表达蛋白进行鉴定;用表达的CD2v-N和CD2v-C蛋白分别肌内接种免疫新西兰大白兔,共免疫3次,每次间隔2周;每次免疫后14 d,应用ELISA方法测定CD2v-N或CD2v-C的特异性抗体水平;用纯化后的CD2V-N和CD2v-C蛋白作为包被抗原,通过ELISA方法检测95份ASFV感染猪的血清CD2v-N或CD2v-C特异性抗体,比较CD2v-N和CD2v-C在猪体内诱导的免疫反应水平。【结果】重组蛋白CD2v-N和CD2v-C分别以包涵体和可溶性形式表达,分子质量分别为22.9和34.0 ku,均能与猪抗ASFV血清特异性结合;用CD2v-N蛋白首免家兔后14 d,血清中未检测到特异性抗体,而在CD2v-C首免的家兔血清中检测到了高滴度的特异性抗体;三免后14 d,CD2v-N和CD2v-C蛋白免疫家兔的血清特异性抗体效价分别为1∶125000和1∶107;ELISA检测结果显示,ASFV感染猪的血清中CD2v-C特异性抗体水平显著高于CD2v-N(P抗原性比后者高,CD2v胞内域作为ASFV免疫学检测技术研究与开发的靶标更具优势。该研究结果对ASFV检测方法的研究与开发具有重要指导意义。

关键词：非洲猪瘟病毒(ASFV) CD2v蛋白胞外域胞内域蛋白表达抗原性

贵州省2022-2023年流感季A(H1N1)pdm09亚型流感病毒抗原性和血凝素基因特征

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中国疫苗和免疫 2024年第3期 278-282页

作者：庄丽柯倩郑菊韦小瑜贵州省疾病预防控制中心

目的了解贵州省A(H1N1)pdm09亚型流感病毒抗原性和血凝素(Hemagglutinin, HA)基因特征。方法选取贵州省流感监测点2022年10月至2023年3月A(H1N1)pdm09亚型流感病毒分离株，采用红细胞凝集抑制试验检测抗原性，测定HA全基因组序列，构... 详细信息

目的了解贵州省A(H1N1)pdm09亚型流感病毒抗原性和血凝素(Hemagglutinin, HA)基因特征。方法选取贵州省流感监测点2022年10月至2023年3月A(H1N1)pdm09亚型流感病毒分离株，采用红细胞凝集抑制试验检测抗原性，测定HA全基因组序列，构建遗传进化树，分析核苷酸同源性和氨基酸位点变异。结果共获得78株A(H1N1)pdm09亚型流感病毒，均鉴定为疫苗类似株。22株毒株获得HA全基因组序列，与疫苗株的核苷酸同源性为97.28%-99.14%;其中6B.1A.5a.2a、6B.1A.5a进化分支分别为19株、3株；19株发生Sb抗原决定簇的A186T和Q189E氨基酸替换并分布在1个抗原决定簇，3株发生Sa抗原决定簇的K156N和I161L氨基酸替换并分布在1个抗原决定簇。19株发生190位螺旋(184-191)A186T和Q189E以及220位环E224A氨基酸替换，3株发生220位环D222Y氨基酸替换，均发生在HA1区域。未发现糖基化位点变异。结论贵州省2022-2023年流感季A(H1N1)pdm09亚型流感病毒与疫苗株匹配性良好，但存在部分氨基酸位点变异。需加强流感病毒监测及其抗原性和基因序列分析，以利于流感防控策略制定和流感疫苗株筛选。

关键词： A(H1N1)pdm09亚型流感病毒抗原性血凝素基因特征

非洲马瘟病毒NS1蛋白在昆虫细胞中的表达及抗原性分析

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中国兽医科学 2024年第3期54卷 350-356页

作者：户鑫兵王轩莹宋昱庆田占成关贵全苟惠天罗建勋殷宏独军政中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室兰州大学动物医学与生物安全学院甘肃兰州730046 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃兰州730046

非洲马瘟(African horse sickness,AHS)是一种由媒介昆虫传播感染马属动物的病毒性疾病,为了在杆状病毒表达系统中表达AHSVNS1蛋白并评估其作为亚单位疫苗组分的抗原性,本研究参考GenBank上公布的AHSV基因序列,人工合成NS1全长基因序列... 详细信息

非洲马瘟(African horse sickness,AHS)是一种由媒介昆虫传播感染马属动物的病毒性疾病,为了在杆状病毒表达系统中表达AHSVNS1蛋白并评估其作为亚单位疫苗组分的抗原性,本研究参考GenBank上公布的AHSV基因序列,人工合成NS1全长基因序列,利用PCR方法扩增完整的开放阅读框后将其克隆到转座载体pFastBacTMHTb上,将成功构建的重组质粒pFastBac-AHSVNS1转化到DH10Bac感受态细胞中,获得了含有AHSVNS1基因的重组杆粒Bacmid-AHSVNS1,将其转染到Sf9昆虫细胞内获得了表达AHSVNS1蛋白的重组杆状病毒。SDS-PAGE和Western-blot结果显示,表达的重组AHSV NS1蛋白大小为65 ku,且获得了纯化的重组AHSV NS1蛋白。将其免疫BALB/c小鼠,细胞免疫荧光和Western-blot试验显示获得了特异性的抗AHSV NS1蛋白多克隆抗体,其效价达1∶51 200。流式细胞分析显示,AHSV NS1蛋白免疫小鼠能够刺激CD4+和CD8+T淋巴细胞的增加。上述研究结果表明,AHSV NS1蛋白作为AHSV亚单位疫苗的组成成分具有一定应用前景。本试验实现了AHSV NS1蛋白在昆虫细胞中成功表达并验证其具有良好的抗原性,这为进一步研究AHSV NS1蛋白的生物学功能和亚单位疫苗开发奠定了基础。

关键词：非洲马瘟病毒 AHSV NS1蛋白昆虫细胞表达抗原性

羊种布鲁氏菌Tat系统底物蛋白ErfK的抗原性和免疫原性研究

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中国动物检疫 2024年第5期41卷 96-103页

作者：吴瑶焉鑫孙明军屈海龙郭晓涵闫昊张培培孙世雄李嘉琪孙翔翔刘蒙达张皓博南文龙邵卫星王方昆樊晓旭孙淑芳中国动物卫生与流行病学中心山东青岛266032 山东农业大学动物医学院山东泰安271000 农业农村部动物生物安全风险预警及防控重点实验室(南方) 山东青岛266032 徐州医科大学公共卫生学院江苏徐州221004 新疆维吾尔自治区动物卫生监督所新疆乌鲁木齐830018 农业农村部反刍动物重大疫病防控重点实验室(东部) 山东青岛266032

为分析羊种布鲁氏菌双精氨酸转运系统(twin-arginine translocation system,Tat system)毒力相关底物蛋白L,D-转肽酶ErfK诱导宿主产生的免疫应答情况,首先对布鲁氏菌M28毒株ErfK基因序列(WP_002963714.1)进行生物信息学分析,参考序列设... 详细信息

为分析羊种布鲁氏菌双精氨酸转运系统(twin-arginine translocation system,Tat system)毒力相关底物蛋白L,D-转肽酶ErfK诱导宿主产生的免疫应答情况,首先对布鲁氏菌M28毒株ErfK基因序列(WP_002963714.1)进行生物信息学分析,参考序列设计引物,构建表达载体pET-30a(+)-ErfK,经IPTG诱导表达、亲和层析和镍柱纯化获得目的蛋白;利用SDS-PAGE和Western blot对重组ErfK(rErfK)蛋白进行抗原性鉴定;将rErfK蛋白免疫小鼠,分别在免疫后15、30和45 d收集血清和脾脏,检测蛋白免疫后小鼠的细胞免疫应答和体液免疫应答情况。生物信息学预测结果显示,ErfK蛋白无跨膜结构,为亲水性蛋白,有多个T细胞和B细胞抗原表位;SDS-PAGE和Western blot均可获得25 kDa的蛋白条带,重组蛋白可与布鲁氏菌阳性血清发生反应,证明rErfK有良好的抗原性;小鼠免疫试验结果显示,rErfK组小鼠脾脏CD8^(+)T细胞含量相比PBS组显著上升(P<0.05),且脾脏Th1型细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4转录水平均显著上升(P<0.05),此外,rErfK免疫也能极显著诱导小鼠血清中总IgG和特异性IgG的产生(P<0.01)。上述结果表明,经大肠杆菌表达的布鲁氏菌rErfK蛋白可诱导小鼠产生良好的体液免疫和细胞免疫应答。本研究为基于ErfK蛋白的布鲁氏菌病诊断试剂和亚单位疫苗研发提供了参考依据。

关键词：布鲁氏菌 Tat系统底物蛋白L,D-转肽酶ErfK 抗原性免疫原性

花生致敏蛋白Ara h1与咖啡酸互作对其抗原性的影响

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农业工程学报 2022年第8期38卷 288-296页

作者：任红涛石奇磊李静余秋颖王凡胡梅王娜河南农业大学食品科学技术学院郑州450002 郑州市营养与健康食品重点实验室郑州450002 国际动物免疫学联合研究中心郑州450002 农业农村部大宗粮食加工重点实验室郑州450002 河南农业大学动物医学院郑州450002

为探寻适宜的花生脱敏方法,该文研究了花生致敏蛋白Ara h1与咖啡酸互作对其抗原性的影响,利用荧光光谱、紫外光谱和间接ELISA法对碱法、酶法、自由基法处理后的咖啡酸蛋白复合物抗原性变化进行了分析,并对碱法互作反应温度、反应时间、p... 详细信息

为探寻适宜的花生脱敏方法,该文研究了花生致敏蛋白Ara h1与咖啡酸互作对其抗原性的影响,利用荧光光谱、紫外光谱和间接ELISA法对碱法、酶法、自由基法处理后的咖啡酸蛋白复合物抗原性变化进行了分析,并对碱法互作反应温度、反应时间、pH值、咖啡酸浓度进行优化。结果表明:在温度33.2℃、时间25 h、pH值8.67和咖啡酸浓度1.76 mg/mL时,咖啡酸与花生致敏蛋白Ara h1碱法互作后其抗原性降至69.31%,接枝量为119.16 nmol/mg。碱法处理后,咖啡酸与花生致敏蛋白Ara h1互作能降低致敏蛋白抗原性,研究结果可为花生脱敏处理提供参考。

关键词：蛋白优化花生致敏蛋白Ara h1 抗原性咖啡酸

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糖基化对疫苗免疫原性影响的研究进展

中国新药杂志 2024年第3期33卷 241-246页

作者：王鹤儒吴业红何鹏胡忠玉中国食品药品检定研究院北京102629 长春生物制品研究所有限责任公司长春130062

糖基化修饰是一种重要的蛋白翻译后修饰,细胞膜上的蛋白一般多为糖蛋白,细胞内也不断发生着不同类型的糖基化修饰反应。糖蛋白参与到宿主的众多生命过程中,包括细胞生长、细胞间相互识别、免疫应答、病毒入侵及炎症反应的发生等。随着... 详细信息

糖基化修饰是一种重要的蛋白翻译后修饰,细胞膜上的蛋白一般多为糖蛋白,细胞内也不断发生着不同类型的糖基化修饰反应。糖蛋白参与到宿主的众多生命过程中,包括细胞生长、细胞间相互识别、免疫应答、病毒入侵及炎症反应的发生等。随着蛋白质组学和糖组学技术的不断完善,蛋白的糖基化修饰研究得到越来越广泛的重视。随着生物技术的不断发展,研究方法不断完善,我们对糖基化修饰所带来的蛋白功能与构象的改变也有了越来越清楚的了解。关于糖型分析及糖蛋白上不同糖型比例的问题也随着糖蛋白的检测、分离纯化、糖基化氨基酸位点测定、糖链结构的分析等实验技术的不断完善得到解决。糖基化对多种疫苗候选抗原的免疫原性影响已有许多相关研究,例如乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)、流感病毒以及新型冠状病毒等疫苗抗原/候选抗原都有不同程度糖基化修饰,糖基化修饰对这些疫苗抗原的影响同样非常重要。本文就糖基化研究方法及糖基化对多种疫苗免疫原性的影响进行综述。

关键词：糖基化疫苗免疫原性抗原抗原性

欧亚类禽H1N1猪流感病毒抗原性变异关键氨基酸的鉴定与分析

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中国农业科学 2023年第14期56卷 2828-2836页

作者：张乃心许程志杨玉莹张亚萍万云飞乔传玲陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/动物疫病防控全国重点实验室

【背景】流感病毒的抗原性主要是由病毒的表面糖蛋白HA决定的，前期利用欧亚类禽型H1N1猪流感病毒（EA H1N1 SIV）HA蛋白单克隆抗体（mAb）筛选抗原逃逸株发现，HA蛋白190、230和269位（H3编码）氨基酸的改变能够导致病毒发生抗原逃逸... 详细信息

【背景】流感病毒的抗原性主要是由病毒的表面糖蛋白HA决定的，前期利用欧亚类禽型H1N1猪流感病毒（EA H1N1 SIV）HA蛋白单克隆抗体（mAb）筛选抗原逃逸株发现，HA蛋白190、230和269位（H3编码）氨基酸的改变能够导致病毒发生抗原逃逸，并发现在新近分离的EA H1N1 SIV HA蛋白广泛存在这3个氨基酸的变异。【目的】进一步探索哪些氨基酸对病毒的抗原性具有关键作用，为流感的防控提供科学依据。【方法】选取一株病毒A/swine/Liaoning/SY72/2018(H1N1) SY72为模式病毒，建立该病毒的反向遗传系统（RGS），又以SY72为骨架，拯救含有HA基因190、230和269单点突变重组病毒；利用rSY72病毒制备灭活疫苗，分别免疫SPF鸡和非免疫猪制备其相应的血清，通过中和试验和血凝抑制（HI）试验分析病毒的抗原性，确定影响病毒抗原性的关键氨基酸位点；继而评估HA蛋白不同位点氨基酸的改变对病毒复制特性及受体结合特性等的影响。【结果】分析SY72病毒的HA氨基酸序列发现，该病毒HA蛋白分别含有190D、230M和269R。利用反向遗传技术，分别拯救了病毒rSY72及单点突变病毒rSY72HA/D190N、rSY72HA/M230I和rSY72HA/R269M；中和试验结果表明，与rSY72相比较，3株突变病毒均能够与两株mAbs发生一定反应；HI试验结果显示，与rSY72相比较，突变病毒rSY72HA/D190N与rSY72免疫鸡血清和猪血清的反应减弱，HI抗体效价分别出现了4倍和8倍的差异，而病毒rSY72HA/M230I和rSY72HA/R269M与两种血清的反应差异不明显，表明HA蛋白190位氨基酸改变对病毒的抗原性影响最为明显；病毒蚀斑测定及复制动力学研究结果发现D190N的氨基酸替换导致病毒rSY72HA/D190N在MDCK细胞上形成的蚀斑减小，而R269M的氨基酸替换导致病毒rSY72HA/R269M在MDCK细胞上的复制能力下降；3个位点的氨基酸替换均未影响病毒的受体结合特性。【结论】HA蛋白190位氨基酸对EA H1N1 SIV抗原性具有决定作用，269位氨基酸突变使得病毒在MDCK细胞上的复制能力降低。这提示在后续开展的病原学监测中要密切关注这些氨基酸的变异情况，提高对动物流感的预警预报。

关键词：猪流感病毒 HA蛋白抗原性