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抑癌蛋白PTEN的去泛素化酶0TUD3转基因小鼠模型的建立及表型分析

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抑癌蛋白PTEN的去泛素化酶0TUD3转基因小鼠模型的建立及表型分析

作者：李洪昌中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

PTEN是1997年新发现的定位在第10号染色体上的抑癌基因,经过18年的研究发现它是在肿瘤的发生与发展中具有重要的抑癌作用。PTEN在脑胶质瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等多种肿瘤中具有很高的突变率或低表达率,并且在Cowden综合症、Bannaya... 详细信息

PTEN是1997年新发现的定位在第10号染色体上的抑癌基因,经过18年的研究发现它是在肿瘤的发生与发展中具有重要的抑癌作用。PTEN在脑胶质瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等多种肿瘤中具有很高的突变率或低表达率,并且在Cowden综合症、Bannayan-Zonana综合症等肿瘤易感性疾病中也有很高的遗传性突变。此外,PTEN基因杂合缺失的小鼠能自发形成乳腺癌、甲状腺瘤、子宫内膜瘤等多种肿瘤,并且PTEN基因纯合缺失的小鼠也因细胞增殖过快而细胞程序性死亡不足在胚胎期9.5天出现死亡。最近对PTEN转基因小鼠的研究还发现,PTEN在小鼠体内过表达后,小鼠对肿瘤抵抗能力增强。这些证据都表明:PTEN是一个重要的抑癌基因。PTEN在细胞内既定位在细胞质,也定位在细胞核。细胞质内的PTEN可以利用其脂质磷酸酯酶活性,逆转PI3K的磷酸化作用,抑制PI3K-Akt与m TOR信号通路,发挥抑癌功能;而在细胞核内,PTEN主要通过维持基因组稳定性发挥抑癌功能。目前的研究发现PTEN对肿瘤发生的抑制作用与以往理解的“单倍剂量不足”理论不同,其蛋白水平的微量变化即与肿瘤的发生密切相关。当PTEN蛋白水平减少至80%时,乳腺癌的发生率就高达40%,足以说明PTEN剂量变化对肿瘤易感性存在重要影响。虽然PTEN从转录到翻译表达的过程中受到磷酸化、乙酰化、泛素化、类泛素化等多种修饰,但在细胞内,蛋白质的稳定依然主要由泛素化修饰调节。泛素化修饰在生物体内是一个平衡的调节系统,泛素化修饰与去泛素化修饰共同作用调控蛋白质的稳定性。目前发现的PTEN的泛素连接酶已有5个(NEDD4-1、WWP2、XIAP、CHIP、TRIM27/RFP),但直到我们开展筛选能调控PTEN蛋白稳定性的去泛素化酶这个工作时,能调控PTEN蛋白稳定性的去泛素化酶依然未被揭示。我们通过对人类去泛素化酶库中的接近90个去泛素化酶筛选后,发现并验证了OTU家族的去泛素化酶OTUD3(OTU Domain Containing 3)是一个能够去除PTEN泛素化,调节其蛋白稳定性的去泛素化酶。并且,细胞学实验也表明OTUD3可以通过稳定PTEN的蛋白水平抑制PI3K-Akt通路,抑制细胞增殖、迁移和成瘤能力。既然OTUD3在分子与细胞实验中能够利用其去泛素化酶活性,稳定PTEN蛋白水平并发挥抑癌功能,那是否在生理条件下OTUD3也具有同样的功能呢?围绕着“在生理条件下OTUD3是否能稳定PTEN并发挥抑癌功能”这一科学问题,我们利用基因工程技术,采用能够保护插入片段完整高效表达的人工细菌染色体(BAC)策略,构建了OTUD3与PTEN转基因小鼠模型,并对表型进行分析研究。通过分离培养小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞,对OTUD3与PTEN转基因小鼠单独建系并开展了一系列实验。结果发现:在OTUD3转基因小鼠中,OTUD3与PTEN存在相互作用,PTEN蛋白水平显著高于野生型小鼠,并且这一作用是通过去除PTEN的泛素化,稳定其蛋白水平实现的。此外,我们利用MEF细胞开展实验发现OTUD3在小鼠原代细胞中能够通过稳定PTEN蛋白水平参与抑制PI3K-Akt信号通路。在动物的整体表型上,我们对这两个小鼠模型的梯度表达系小鼠进行观察后发现:OTUD3转基因小鼠与PTEN转基因小鼠在体型上均小于野生型小鼠,并随着OTUD3与PTEN表型量的增加而逐渐明显。说明OTUD3在体内过表达后,能使PTEN蛋白水平上升并发挥其在代谢上在体过表达后调控小鼠体型大小的功能。MMTV-Py V MT转基因小鼠可以自发形成乳腺癌,是用于乳腺癌研究的经典小鼠模型。为了在体内研究OTUD3的抑癌功能,我们将OTUD3转基因小鼠与MMTV-Py V MT转基因小鼠交配构建转基因小鼠双杂模型,跟踪观察OTUD3在乳腺癌发生发展中的作用。研究发现OTUD3在体内过表达后,不论是在肿瘤形成的时间上,还是数量与大小上,都对乳腺癌的发生与发展具有显著的抑制作用。从遗传学上充分证明OTUD3是PTEN的一个重要的稳定调控因子,在体内OTUD3发挥着重要的抑癌功能。本文还探究了在不同的乳腺癌细胞系中OTUD3与PTEN蛋白水平的关系。通过对比发现在有PTEN表达的乳腺癌细胞系中,OTUD3的表达量与PTEN蛋白水平基本上是一致的,说明OTUD3对PTEN的调控作用是普遍存在的,而不是仅仅是在某些特定的乳腺癌细胞系中。此外,OTUD3在高转移能力的乳腺癌细胞系中异常低表达,提示OTUD3在乳腺癌中可能参与肿瘤的转移或耐药过程。本文通过免疫组织化学实验探讨了OTUD3、USP13与PTEN在乳腺癌组织中蛋白水平的关系。结果显示OTUD3与USP13在乳腺癌组织中对PTEN的蛋白稳定性调控上具有协同作用,当二者在肿瘤组织中蛋白水平都低时,PTEN的蛋白水平最低,反之亦然;而当一高一低时,PTEN蛋白处于中等水平。我们的研究通过利用OTUD3转

关键词： PTEN 去泛素化酶 OTUD3转基因小鼠抑癌乳腺癌

利用茶多糖或BSA制备纳米CuET及其抑癌作用研究

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利用茶多糖或BSA制备纳米CuET及其抑癌作用研究

作者：何玉凤安徽农业大学

学位级别：硕士

DSF是一种治疗酒精依赖症的药物,DEDTC是DSF的主要活性代谢产物,DEDTC（或DSF）具有抑癌作用,当DEDTC与铜按照2:1的比例结合形成CuET以后的抑癌效果更显著。但是DEDTC和铜在水中互不相溶,容易生成沉淀,因为存在溶解性问题,所以动物实验... 详细信息

DSF是一种治疗酒精依赖症的药物,DEDTC是DSF的主要活性代谢产物,DEDTC（或DSF）具有抑癌作用,当DEDTC与铜按照2:1的比例结合形成CuET以后的抑癌效果更显著。但是DEDTC和铜在水中互不相溶,容易生成沉淀,因为存在溶解性问题,所以动物实验只能采用分开给药的方式。这种分开给药的方式就会造成DEDTC与铜在动物体内的比例不固定,两者盲目结合,所以无法判断体内形成多少CuET,这就阻碍了我们认识CuET的安全性与疗效。尽管CuET潜力巨大但却无法进入临床前药理与毒理评价。因此,CuET的溶解性问题丞待解决,而运用纳米技术将CuET制备成纳米颗粒是解决其溶解性问题的有效方式之一。茶多糖是茶叶中的糖类或与蛋白质相结合形成的一类酸性多糖或酸性糖蛋白。茶多糖因为其毒性极低,并具有降血糖、抗氧化、调节免疫等多种生物功效,所以被认为是一种健康的材料。近年来开始出现茶多糖用于纳米制备的研究,这就提示我们可以利用茶多糖制备出纳米CuET,从而解决其不溶性问题。另一方面,牛血清白蛋白（BSA）,因其具有易溶于水,无毒性,无免疫排斥反应,具有良好的生物相容性,优先集聚在肿瘤组织中,能够生物降解,成本低等优点而得到众多研究者的青睐,目前已经有大量研究成果就是利用BSA制备出纳米材料,BSA因此也被认为是理想的纳米分散剂。基于上述原由,我们首次利用茶多糖或BSA作为纳米分散剂制备出纳米CuET,并对该纳米材料进行表征和稳定性分析以及对其安全性和药理药效做出评价。此外,我们还利用制备的纳米CuET,初步研究了其与茶氨酸联合使用后的抑癌效果。本研究主要取得的研究结果如下:（1）利用茶多糖或BSA制备出纳米CuET,两种纳米颗粒的尺寸分别约为81 nm和20 nm。接下来,我们对制备的两种纳米材料的稳定性进行了研究,结果表明,相较于放在室温环境下,温度在4℃时,纳米CuET的尺寸、Zeta电位和PDI指标都显示在低温环境下更加稳定。在研究制备的纳米CuET的抑癌效果时,我们主要从细胞层面上通过细胞毒实验、克隆实验和划痕实验对两种纳米材料的抑癌效果进行了评价,结果显示两种材料对TCA8113细胞的抑制效果显著,且两种材料的给药剂量相当。最后,我们利用TCA8113细胞研究了两种材料对细胞内的GSH含量的影响,结果表明,给药处理7 h后细胞后的GSH含量明显下降。（2）接下来我们利用BSA制备的纳米CuET研究了其抑癌相关的蛋白表达情况,在动物上的给药最大耐受剂量以及对利用H22细胞建立的癌症模型的抑制效果研究。结果发现,在细胞实验上,纳米CuET主要能够调动凋亡相关蛋白γ-H2AX、Cl-caspase 3、Cl-PARP、p21等的表达,抑制了NFκB/P65和PI3K的表达,此外,纳米CuET处理后促进了蛋白泛素化表达。在动物实验上,我们首先研究了纳米CuET的给药安全剂量和最大耐受剂量,在单针腹腔给药0.4和0.6 mg Cu/kg体重剂量7天后,0.6 mg Cu/kg剂量的小鼠出现毒副反应;连续7天腹腔给药0.3和0.4 mg Cu/kg体重剂量后发现0.4 mg Cu/kg剂量致使小鼠出现毒性反应。利用研究出的给药剂量,我们接下来研究了纳米CuET在无毒剂量下对小鼠H22肝腹水模型的抑制情况,结果表明纳米CuET对该模型具有显著的抑制效果。同样地,给药后的小鼠H22细胞内的GSH含量明显下降,并且也能够调动凋亡相关蛋白并抑制促生长的相关蛋白的表达以及使蛋白泛素化表达。（3）最后,我们利用Hep G2细胞通过细胞毒实验和克隆实验初步研究了茶氨酸对BSA制备的纳米CuET抑癌效果的影响,结果显示,在细胞毒实验上茶氨酸本身产生的细胞毒低,但是能够加强纳米CuET对细胞增殖的杀伤效果,同时,在克隆实验上结果显示5 m M的茶氨酸不抑制细胞集落的生成,但是能够促进纳米CuET对细胞集落生成的抑制效果。这样的结果初步表明,茶氨酸能够加强纳米CuET的抑癌效果。

关键词：茶多糖牛血清白蛋白 CuET 茶氨酸纳米颗粒抑癌

MicroRNA-29a通过调节胶质瘤中Sp1的表达发挥抑癌作用的机制研究

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MicroRNA-29a通过调节胶质瘤中Sp1的表达发挥抑癌作用的机制研究

作者：卢忠胜苏州大学

学位级别：硕士

背景与目的:胶质瘤是常见的颅内恶性肿瘤,占中枢神经系统肿瘤的27%,且发病率有逐年递增的趋势,年增长率约为1%-2%,其中约75%的肿瘤发现时已是中晚期,尽管通过手术以及放化疗等综合治疗,5年生存率仍很低。胶质瘤的发病机制至今尚不完全明... 详细信息

背景与目的:胶质瘤是常见的颅内恶性肿瘤,占中枢神经系统肿瘤的27%,且发病率有逐年递增的趋势,年增长率约为1%-2%,其中约75%的肿瘤发现时已是中晚期,尽管通过手术以及放化疗等综合治疗,5年生存率仍很低。胶质瘤的发病机制至今尚不完全明确,大量资料表明,物理、化学、病毒以及遗传等综合因素都与胶质瘤的发生密切相关。我们的研究发现在胶质瘤细胞中转录因子Sp1的表达是升高的,这与之前的研究中发现Sp1能促进肿瘤的发生和发展是一致的,但具体的作用机制尚不明确。MicroRNA对基因表达的调控是其与特定靶基因3’UTR种子序列的完全或不完全互补配对来实现的,研究表明在肿瘤的进展过程中检测到了microRNAs表达的改变。预测显示多个microRNAs可以靶向Sp1的3’UTR区域,同时我们发现在胶质瘤中microRNA-29a（miR-29a）是低表达的,因此我们推测在转录因子Sp1与miR-29a之间可能存在着某种联系。本研究旨在探讨胶质瘤中Sp1表达的microRNA调控机制,为胶质瘤的诊疗提供确切的实验理论依据。方法:（1）在人正常神经胶质细胞和4株胶质瘤细胞中用Real-Time PCR方法分别检测Sp1 mRNA和miR-29a的表达水平,用Western Blot方法检测细胞中Sp1表达的蛋白水平。（2）用转染试剂Lipofectamine 2000瞬时转染miR-NC/29a mimics及si-NC/Sp1,Real-Time PCR和Western Blot实验检测过表达miR-29a后Sp1mRNA和蛋白的表达水平。（3）生物学信息分析软件TargetSpy和在线数据库Targetscan、miRBase预测显示miR-29a能靶向Sp1 3’UTR区,用双荧光实验检测miR-29a能否与Sp1 3’UTR区的特定序列相结合,用于证实其直接靶向作用。（4）Transwell实验检测U87和A172细胞的转移和侵袭能力,在U87和A172细胞瞬转miR-29a后,用Real-Time PCR和Western Blot检测Sp1的干扰效果,接着使用Transwell检测Sp1干扰后U87和A172细胞的转移和侵袭的变化;将模拟体miR-29a瞬时转染到U87和A172细胞后,再运用Transwell检测细胞的转移和侵袭的变化。结果:（1）a、与OLN93相比,Sp1 mRNA和蛋白在胶质瘤细胞株U87、A172、U251和SHG44中的表达均是上升的,转录因子Sp1在胶质瘤细胞中是高表达的。（2）与OLN93相比,在胶质瘤细胞株U87、A172、U251和SHG44中miR-29a的表达是下调的,在胶质瘤细胞中miR-29a是低表达的。（3）miR-29a在U87和A172细胞中通过直接靶向Sp1 3’UTR区抑制Sp1的表达:在U87和A172细胞中过表达miR-29a后,Sp1 mRNA和蛋白表达水平均下调。为证实miR-29a和Sp1的直接靶向作用,通过双荧光实验的结果表明,在U87和A172细胞中共转染野生型载体时出现下调,而共转染突变型载体时没有变化,证实了miR-29a可以直接靶向Sp1 3’UTR区。（4）U87和A172细胞中过表达miR-29a后的表型研究:U87和A172过表达miR-29a后,细胞的转移和侵袭能力均显著抑制;相似地在干扰Sp1后,细胞的转移和侵袭能力都受到遏制。结论:在胶质瘤细胞中,miR-29a低表达,转录因子Sp1高表达,并且miR-29a可以直接靶向Sp1的3’UTR特定序列。对miR-29a和Sp1功能分析可知,miR-29a可使肿瘤的转移和侵袭受到抑制,而Sp1则能增强肿瘤的转移和侵袭能力,过表达miR-29a后,Sp1 mRNA和蛋白的表达均出现下调。因此,miR-29a可能作为一种抑癌因子,在胶质瘤的进展过程中,通过抑制Sp1的表达来抑制肿瘤的发展。通过研究miR-29a对Sp1基因的抑制作用可能会有助于提高我们对胶质瘤的致病机制的了解,进而对胶质瘤的诊断和治疗提供可靠的理论基础。

关键词：胶质瘤 miR-29a Sp1 抑癌

多西紫杉醇对原发性肝癌抑癌及增敏效应的研究

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多西紫杉醇对原发性肝癌抑癌及增敏效应的研究

作者：吴敏昆明医科大学

学位级别：硕士

[目的]通过人肝癌细胞株SMMC-7221荷瘤裸鼠体外动物模型实验,考察多西紫杉醇对人肝癌细胞株SMMC-7221的抑癌及放疗增敏效果。通过检测VEGF蛋白的阳性表达水平,观察多西紫杉醇的抗血管生成作用,分析VEGF蛋白与多西紫杉醇抑癌作用的相关性... 详细信息

[目的]通过人肝癌细胞株SMMC-7221荷瘤裸鼠体外动物模型实验,考察多西紫杉醇对人肝癌细胞株SMMC-7221的抑癌及放疗增敏效果。通过检测VEGF蛋白的阳性表达水平,观察多西紫杉醇的抗血管生成作用,分析VEGF蛋白与多西紫杉醇抑癌作用的相关性,并进一步研究其放疗增敏作用与调节肿瘤血管的关系。[方法]以人肝癌细胞株SMMC-7221为对象进行实验,建立荷瘤裸鼠动物模型：1.监测裸鼠移植瘤皮下瘤体的体积及瘤重,绘制生长曲线。2.HE染色观察裸鼠皮下移植瘤组织形态学改变。3.运用Tunel检测裸鼠移植瘤皮下肿瘤癌细胞凋亡情况。4.运用免疫组化的方法检测裸鼠移植瘤肿瘤中VEGF蛋白的表达水平。[结果]1.多西紫杉醇联合伽马刀照射组、单纯多西紫杉醇组及单纯伽马刀照射组裸鼠瘤体的体积、瘤重均小于空白对照组,其中多西紫杉醇联合伽马刀照射组瘤体生长抑制作用最明显;多西紫杉醇的增敏系数为1.55。2.在四个处理组中,瘤体组织癌细胞形态皱缩、密度减少、癌巢形成及癌巢内坏死无细胞程度：多西紫杉醇联合伽马刀照射组>单纯多西紫杉醇组>单纯伽马刀照射组>空白对照组。3.与空白对照组对比,单纯伽马刀照射组肝癌细胞中VEGF蛋白表达水平增加,单纯多西紫杉醇组VEGF蛋白表达水平降低,多西紫杉醇联合伽马刀照射组中VEGF蛋白表达水平最低。[结论]1.多西紫杉醇对肝癌细胞株SMMC-7221具有较强的抑癌效应;多西紫杉醇联合伽马刀照射治疗能提高抑癌效应;多西紫杉醇能提高肝癌细胞对放射线的敏感性。2.多西紫杉醇可降低VEGF蛋白的表达,抑制血管形成,提示多西紫杉醇对肝癌细胞的抑癌效应与肿瘤新生血管形成减少有关。3.多西紫杉醇联合伽马刀照射治疗可以明显降低VEGF蛋白的表达,对血管形成的抑制作用明显,提示多西紫杉醇的放射增敏作用与抑制肝癌新生血管形成有关。

关键词：多西紫杉醇抑癌放射增敏血管形成 VEGF

3p21·3区域肺癌相关基因RASSF1A的抑癌功能研究

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中华医学杂志 2005年第13期85卷 908-911页

作者：张森邵康张翠艳周芳王伟熊美华赫捷中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院胸外科实验室北京100021

目的观察将野生型RASSF1A通过质粒载体pcDNA3·1导入不表达该基因的非小细胞肺癌(NSCL)细胞系A549后,肺癌细胞生物学特性的变化。方法通过脂质体Lipofectamine2000将质粒载体pcDNA3·1,pcDNA3·1-RASSF1A分别转染入A549细胞系中,通过流... 详细信息

目的观察将野生型RASSF1A通过质粒载体pcDNA3·1导入不表达该基因的非小细胞肺癌(NSCL)细胞系A549后,肺癌细胞生物学特性的变化。方法通过脂质体Lipofectamine2000将质粒载体pcDNA3·1,pcDNA3·1-RASSF1A分别转染入A549细胞系中,通过流式细胞仪检测瞬时转染该基因对细胞周期的影响以及是否诱发凋亡;通过绘制细胞生长曲线,MTT检测,以及集落形成实验来分析稳定转染细胞的生物学特性;同时分析稳定转染RASSF1A对A549细胞裸鼠转移能力的影响。结果瞬时转染RASSF1A使细胞周期阻断在G1/S期(P抑制(P抑制肿瘤细胞的生长和转移,提示该基因在肺癌的发生发展中发挥重要作用。

关键词： 3p21.3区域肺癌相关基因功能研究 pcDNA3.1 RASSF1A基因细胞生物学特性 A549细胞系流式细胞仪检测抑癌非小细胞肺癌细胞生长曲线稳定转染细胞集落形成实验细胞周期阻断集落形成能力抑制肿瘤细胞质粒载体

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缢蛏蛋白组分Y_3的提取及抑癌活性研究

渔业科学进展 2011年第6期32卷 76-79页

作者：赵艳景王晨淮海工学院江苏省海洋生物技术重点建设实验室连云港222005

以新鲜缢蛏Sinonovacula constrzcta为材料,经25mmol/LTris-HCl(pH7.5,含0.14mol/LNaCl)缓冲液提取缢蛏粗蛋白、透析、DEAE离子交换层析、SepharoseCL-6B凝胶层析,得到1种具有抑癌生物活性的缢蛏蛋白组分Y3。SDS-PAGE电泳测得该蛋白组分的分子量约为64kD。采用MTT比色法检测Y3对4种肿瘤细胞增殖的影响。结果显示,Y3对Hela和BGC803细胞有明显的抑制作用,而对SKOV3和HepG2抑制作用不明显。此外,探讨了Y3对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除能力。结果显示,该蛋白组分清除自由基的能力很强,在浓度为100μg/ml时,Y3对羟基自由基清除率达到92.71%。在3μg/ml下,对超氧阴离子自由基的清除率达到59.73%。

关键词：缢蛏分离纯化抗氧化活性抑癌

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抑癌蛋白CYLD调控纺锤体定向

遗传 2014年第3期36卷 275-275页

作者：本刊讯

[本刊讯]细胞分裂方向的确定对于细胞命运的决定和组织的形成十分重要，此过程依赖于有丝分裂纺锤体相对于细胞皮层的精确旋转（即纺锤体定向）。纺锤体定向错误会导致发育异常以及肿瘤等疾病的发生，但有关的分子机制尚不清楚。在国家... 详细信息

[本刊讯]细胞分裂方向的确定对于细胞命运的决定和组织的形成十分重要，此过程依赖于有丝分裂纺锤体相对于细胞皮层的精确旋转（即纺锤体定向）。纺锤体定向错误会导致发育异常以及肿瘤等疾病的发生，但有关的分子机制尚不清楚。在国家科技部973计划课题和国家自然科学基金的资助下，南开大学生命科学学院药物化学生物学国家重点实验室周军教授课题组的博士生杨云帆等人发现抑癌蛋白CYLD在纺锤体定向过程中发挥重要作用，并进一步证明CYLD通过结合微管和去泛素化酶的双重功能来调节纺锤体定向。一方面，CYLD直接结合并促进了纺锤体上星体微管的组装，

关键词：纺锤体蛋白抑癌国家自然科学基金国家重点实验室调控细胞分裂生命科学学院

肿瘤微环境中的免疫细胞亚群代谢:促癌还是抑癌?

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肿瘤代谢与营养电子杂志 2015年第3期2卷 5-9页

作者：刘秋燕第二军医大学免疫研究所医学免疫学国家重点实验室上海200433

肿瘤是在与机体免疫系统的斗争中发展壮大的,肿瘤微环境是肿瘤与免疫系统斗争中形成的一个强大的保护网,是肿瘤免疫逃逸的前提和保障.肿瘤微环境分为细胞组分和非细胞组分,细胞组分除了肿瘤细胞（肿瘤干细胞）、基质细胞、内皮细胞,还... 详细信息

肿瘤是在与机体免疫系统的斗争中发展壮大的,肿瘤微环境是肿瘤与免疫系统斗争中形成的一个强大的保护网,是肿瘤免疫逃逸的前提和保障.肿瘤微环境分为细胞组分和非细胞组分,细胞组分除了肿瘤细胞（肿瘤干细胞）、基质细胞、内皮细胞,还包括大量肿瘤相关纤维母细胞（cancer associated fibroblasts,CAF）.

关键词：免疫细胞亚群肿瘤微环境机体免疫系统抑癌促癌代谢肿瘤免疫逃逸肿瘤干细胞

促凋融合蛋白GZMB-CASP3和FLAG-BOK的功能研究及抑癌效果比较

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促凋融合蛋白GZMB-CASP3和FLAG-BOK的功能研究及抑癌效果比较

作者：宁航沈阳药科大学

学位级别：硕士

融合蛋白技术是在现今成熟并且应用广泛的生物工程手段,利用分子生物学手段构建的促凋亡融合蛋白表达载体在癌症研究和肿瘤基因治疗领域发挥着重大作用,本课题构建两种促凋亡的融合蛋白表达载体,分别命名为pCTEL-FLAG-Bok和pCDNA-GZMB-C... 详细信息

融合蛋白技术是在现今成熟并且应用广泛的生物工程手段,利用分子生物学手段构建的促凋亡融合蛋白表达载体在癌症研究和肿瘤基因治疗领域发挥着重大作用,本课题构建两种促凋亡的融合蛋白表达载体,分别命名为pCTEL-FLAG-Bok和pCDNA-GZMB-CASP3（GZMB为GranzymeB颗粒酶B的缩写,CASP3为Caspase3的缩写）,再转染到多种细胞中表达融合蛋白,并且初步的在细胞和蛋白水平研究其促凋亡及抑制细胞增殖的作用,最后将两种促凋融合蛋白的作用进行比较。为研究pCTEL-FLAG-Bok和pCDNA-GZMB-CASP3的功效,我们将其转染入COS7,Hela,MCF7细胞中,Western Blot方法检测融合蛋白的表达情况,再在细胞和蛋白水平上研究其功效,在细胞形态学水平上,我们利用显微镜及多种染色手段观察融合蛋白表达后引起的细胞形态变化来判断其凋亡与否;在蛋白水平上,我们用Wesern Blot方法在蛋白水平检测凋亡下游蛋白的表达来证明其促凋亡效果,最后用MTT发检测融合蛋白对细胞增殖速率的影响,并将两种蛋白的促凋抑癌功效加以比较。结果表明,两种蛋白均能在肿瘤细胞中表达,而pCTEL-FLAG-Bok不能在COS7细胞中表达。表达两种融合蛋白后细胞均出现部分凋亡细胞的形态,Western Blot实验也检测到凋亡标志性蛋白的表达,证明两种融合蛋白均如设计目的一样为促凋融合蛋白。MTT实验结果显示,两种融合蛋白均不同程度的抑制肿瘤细胞的生长。所以本课题构建的两种融合蛋白表达载体pCTEL-FLAG-Bok和pCDNA-GZMB-CASP3可以作为今后的研究和基因治疗有用的促凋蛋白表达载体。

关键词： Bok GranzymeB Caspase3 凋亡抑癌