MicroRNA-29a通过调节胶质瘤中Sp1的表达发挥抑癌作用的机制研究

作     者：卢忠胜 

作者单位：苏州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李向东

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：胶质瘤 miR-29a Sp1 抑癌 

摘      要：背景与目的:胶质瘤是常见的颅内恶性肿瘤,占中枢神经系统肿瘤的27%,且发病率有逐年递增的趋势,年增长率约为1%-2%,其中约75%的肿瘤发现时已是中晚期,尽管通过手术以及放化疗等综合治疗,5年生存率仍很低。胶质瘤的发病机制至今尚不完全明确,大量资料表明,物理、化学、病毒以及遗传等综合因素都与胶质瘤的发生密切相关。我们的研究发现在胶质瘤细胞中转录因子Sp1的表达是升高的,这与之前的研究中发现Sp1能促进肿瘤的发生和发展是一致的,但具体的作用机制尚不明确。MicroRNA对基因表达的调控是其与特定靶基因3’UTR种子序列的完全或不完全互补配对来实现的,研究表明在肿瘤的进展过程中检测到了microRNAs表达的改变。预测显示多个microRNAs可以靶向Sp1的3’UTR区域,同时我们发现在胶质瘤中microRNA-29a（miR-29a）是低表达的,因此我们推测在转录因子Sp1与miR-29a之间可能存在着某种联系。本研究旨在探讨胶质瘤中Sp1表达的microRNA调控机制,为胶质瘤的诊疗提供确切的实验理论依据。方法:（1）在人正常神经胶质细胞和4株胶质瘤细胞中用Real-Time PCR方法分别检测Sp1 mRNA和miR-29a的表达水平,用Western Blot方法检测细胞中Sp1表达的蛋白水平。（2）用转染试剂Lipofectamine 2000瞬时转染miR-NC/29a mimics及si-NC/Sp1,Real-Time PCR和Western Blot实验检测过表达miR-29a后Sp1mRNA和蛋白的表达水平。（3）生物学信息分析软件TargetSpy和在线数据库Targetscan、miRBase预测显示miR-29a能靶向Sp1 3’UTR区,用双荧光实验检测miR-29a能否与Sp1 3’UTR区的特定序列相结合,用于证实其直接靶向作用。（4）Transwell实验检测U87和A172细胞的转移和侵袭能力,在U87和A172细胞瞬转miR-29a后,用Real-Time PCR和Western Blot检测Sp1的干扰效果,接着使用Transwell检测Sp1干扰后U87和A172细胞的转移和侵袭的变化;将模拟体miR-29a瞬时转染到U87和A172细胞后,再运用Transwell检测细胞的转移和侵袭的变化。结果:（1）a、与OLN93相比,Sp1 mRNA和蛋白在胶质瘤细胞株U87、A172、U251和SHG44中的表达均是上升的,转录因子Sp1在胶质瘤细胞中是高表达的。（2）与OLN93相比,在胶质瘤细胞株U87、A172、U251和SHG44中miR-29a的表达是下调的,在胶质瘤细胞中miR-29a是低表达的。（3）miR-29a在U87和A172细胞中通过直接靶向Sp1 3’UTR区抑制Sp1的表达:在U87和A172细胞中过表达miR-29a后,Sp1 mRNA和蛋白表达水平均下调。为证实miR-29a和Sp1的直接靶向作用,通过双荧光实验的结果表明,在U87和A172细胞中共转染野生型载体时出现下调,而共转染突变型载体时没有变化,证实了miR-29a可以直接靶向Sp1 3’UTR区。（4）U87和A172细胞中过表达miR-29a后的表型研究:U87和A172过表达miR-29a后,细胞的转移和侵袭能力均显著抑制;相似地在干扰Sp1后,细胞的转移和侵袭能力都受到遏制。结论:在胶质瘤细胞中,miR-29a低表达,转录因子Sp1高表达,并且miR-29a可以直接靶向Sp1的3’UTR特定序列。对miR-29a和Sp1功能分析可知,miR-29a可使肿瘤的转移和侵袭受到抑制,而Sp1则能增强肿瘤的转移和侵袭能力,过表达miR-29a后,Sp1 mRNA和蛋白的表达均出现下调。因此,miR-29a可能作为一种抑癌因子,在胶质瘤的进展过程中,通过抑制Sp1的表达来抑制肿瘤的发展。通过研究miR-29a对Sp1基因的抑制作用可能会有助于提高我们对胶质瘤的致病机制的了解,进而对胶质瘤的诊断和治疗提供可靠的理论基础。