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慢病毒介导解偶联蛋白2（UCP2）低表达对神经干细胞作用的体外实验研究

慢病毒介导解偶联蛋白2（UCP2）低表达对神经干细胞作用的体外实...

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作者：胡俊山西医科大学

学位级别：硕士

目的:1.分离、培养及鉴定C57小鼠原代神经干细胞（NSCs）,为研究UCP2基因低表达引起神经管畸形机制提供细胞模型。2.构建有效的UCP2基因RNA干扰载体,确立高效NSCs转染方法,为后面的基因功能研究提供技术支持。3.检测NSCs UCP2基因低表达... 详细信息

目的:1.分离、培养及鉴定C57小鼠原代神经干细胞（NSCs）,为研究UCP2基因低表达引起神经管畸形机制提供细胞模型。2.构建有效的UCP2基因RNA干扰载体,确立高效NSCs转染方法,为后面的基因功能研究提供技术支持。3.检测NSCs UCP2基因低表达后,NSCs活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平和凋亡变化情况,探索UCP2低表达引起神经管畸形发生机制。方法:1.神经干细胞的分离、培养及鉴定:从Ed 14.5天的C57胎鼠脑组织中,通过机械法提取原代NSCs,用免疫荧光染色法,通过检测NSCs的nestin特征蛋白来鉴定NSCs;用10%FBS的DMEM/F12培养液诱导NSCs分化,免疫荧光染色法检测神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特征蛋白NF-H,GFAP和GALC蛋白,来进行NSCs分化鉴定。2.构建UCP2基因RNA干扰慢病毒载体并进行病毒包装:将设计好的siRNA核酸序列合成两条编码shRNA的DNA模板单链,退火形成双链DNA片段,连接到pMagic4.1慢病毒载体的多克隆位点中,构建重组慢病毒载体pNL-EGFP/CMV/WPREdU3-sh mUCP2,再用重组慢病毒载体pNL-EGFP/CMV/WPREdU3-sh mUCP2与第二代慢病毒包装质粒pCD/NL-BH*DDD和膜蛋白表达质粒pLTR-G共转染293T细胞,获得病毒包装后的重组慢病毒载体。3.电转染UCP2 RNA干扰载体构建:电转染所用UCP2 RNA干扰载体为重组慢病毒载体pNL-EGFP/CMV/WPREdU3-sh mUCP2。4.慢病毒转染和电转染效果比较:分别采用慢病毒转染和电转染方法转染NSCs,荧光显微镜观察NSCs内绿色荧光蛋白表达,比较转染率的高低;通过对比转染后48h和72h细胞绿色荧光强弱变化,比较两种转染方法细胞内绿色荧光维持时间。QPCR和Western Blot检测慢病毒转染后UCP2的表达。***水平的检测:用DCFH-DA探针检测未处理空白组、阴性对照组（不针对UCP2基因序列的对照载体慢病毒转染组）、实验组（UCP2基因干扰载体慢病毒转染组）NSCs ROS水平,比较各组NSCs ROS水平高低。6.细胞凋亡的检测:细胞分组同上,通过活化Caspase 3细胞荧光染色法检测Caspase 3活化率,Western Blot检测Caspase 3蛋白表达变化,了解UCP2低表达对NSCs凋亡的影响。7.统计学分析方法:数据用SPSS17.0软件进行分析,用均数±标准差表示,用t检验或秩和检验进行数据分析,P＜0.05,则表示差异有统计学意义,作图用Graphpad Prism v 5.01软件。结果:1.原代提取的NSCs呈悬浮聚团生长,生长状态良好。经NSCs特征性nestin蛋白免疫荧光染色鉴定,呈阳性显色;经诱导分化,神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞特征性蛋白NF-H,GFAP和GALC免疫荧光染色鉴定,呈阳性显色。2.转染后48h,慢病毒转染效率为77.6%±6.6%,电转染效率为29.2%±4.8%,慢病毒转染效率更高,差异有统计学意义（P＜0.01）;转染后72小时,慢病毒转染的NSCs有绿色荧光的占70.1%±5.8%,而电转染的NSCs有绿色荧光的占10.5%±5.1%,慢病毒转染NSCs绿色荧光维持的时间更长且荧光强度更亮。与空白组和阴性对照组比较,UCP2基因慢病毒转染实验组NSCs UCP2表达明显降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。***2基因慢病毒转染实验组NSCs ROS水平比空白组和阴性对照组高,空白组、阴性对照组和实验组的检测值分别为11130±1338、6128±524.2、18560±983.9,差异有统计学意义（P＜0.01）。4.活化Caspase 3荧光染色实验结果显示,与空白组和阴性对照组相比,实验组阳性细胞率更高,空白组、阴性对照组和实验组阳性细胞率分别为5.7%±1.8%、9.7%±1.3%和28%±6.1%,差异有统计学意义（P＜0.01）。Western Blot检测Caspase 3蛋白表达水平,与空白组和阴性对照组相比,实验组Caspase 3蛋白表达水平更高,差异有统计学意义（P＜0.01）。结论:1.成功的提取、培养及鉴定了C57小鼠原代神经干细胞,为后面的实验提供了可靠的细胞模型。2.成功构建UCP2基因RNA干扰慢病毒载体;对于NSCs,慢病毒转染方法比电转染法更高效且持久,为后续的基因功能研究奠定了基础。*** UCP2低表达引起的ROS升高可能与NSCs凋亡有关,而NSCs的过度凋亡可能与神经管畸形的发生有关。

关键词：神经干细胞解偶联蛋白2 慢病毒转染活性氧细胞凋亡

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MACC1过表达对鼻咽癌CNE-2细胞放疗敏感性的影响及其机制的初步研究

MACC1过表达对鼻咽癌CNE-2细胞放疗敏感性的影响及其机制的初步研...

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作者：周琳翔南华大学

学位级别：硕士

目的:本实验旨在探讨MACC1过表达对于鼻咽癌CNE-2细胞放疗敏感性的影响及其机制。方法:(1)本实验采用Western blot技术检测鼻咽癌5-8F、HNE-1、CNE-1、CNE-2细胞株中MACC1的蛋白表达水平。(2)通过慢病毒转染技术建立过表达MACC1的CNE-2... 详细信息

目的:本实验旨在探讨MACC1过表达对于鼻咽癌CNE-2细胞放疗敏感性的影响及其机制。方法:(1)本实验采用Western blot技术检测鼻咽癌5-8F、HNE-1、CNE-1、CNE-2细胞株中MACC1的蛋白表达水平。(2)通过慢病毒转染技术建立过表达MACC1的CNE-2细胞株,筛选出稳定转染的细胞。(3)采用QPCR及WB实验检测MACC1 mRNA及MACC1蛋白的表达,证实上调效率稳定有效后,进行后续细胞功能学实验。(3)实验分为3个组别:实验组(CNE-2 MACC1过表达稳定株组);阴性对照组(CNE-2阴性稳定株组);空白对照组(CNE-2空细胞组)。用克隆形成实验检测MACC1过表达后CNE-2细胞的放射敏感性变化。(4)流式细胞仪(FCM)检测MACC1过表达对CNE-2细胞细胞周期和凋亡的影响。结果:(1)CNE-2细胞瞬时转染效率约为80-90%。倒置荧光显微镜显示各转染组细胞发出GFP荧光。(2)在MACC1基因的慢病毒转染CNE-2细胞48h后,经QPCR检测,通过2-ΔΔCt分析法分析得出实验组MACC1 Ct值为为17.1,提示MACC1mRNA过表达;Western blot实验检测实验组细胞条带明显,提示MACC1蛋白的过表达,MACC1过表达鼻咽癌CNE-2细胞株构建成功。(3)克隆形成实验表明:在0、2、4、6Gy照射剂量下,实验组较空白对照组及阴性对照组存活分数(SF)均增高(P0.05)。构建单击多靶模型拟合细胞存活曲线,实验组、空白对照组及阴性对照组D、D、N分别为(3.48,1.61,1.59)、(2.37,1.26,1.70)、(2.68,1.20,1.57)。实验组对于空白对照组及阴性对照组的放射增敏比(SER)分别为为0.68及0.77。(4)流式细胞仪检测结果表明:与空白对照组及阴性对照组比较,实验组细胞周期G-G期分布减少,S期分布增加,凋亡率减少(P<0.05)。结论:MACC1过表达可降低鼻咽癌CNE-2细胞的放疗敏感性,其机制可能与MACC1过表达鼻咽癌CNE-2细胞G-G期分布减少,S期分布增加以及细胞凋亡减少相关。

关键词： MACC1 慢病毒转染鼻咽癌细胞放射增敏凋亡

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二甲双胍对前列腺癌的抑制效应

二甲双胍对前列腺癌的抑制效应

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作者：章国亮重庆医科大学

学位级别：硕士

目的：通过研究IL-6对前列腺癌细胞增殖、迁移和生存力的影响，探索IL-6在前列腺癌进展中的作用机制;同时研究二甲双胍对IL-6过表达的前列腺癌细胞株增殖、迁移和细胞周期的影响，探索二甲双胍抑制前列腺癌发生发展的相关分子机制。方... 详细信息

目的：通过研究IL-6对前列腺癌细胞增殖、迁移和生存力的影响，探索IL-6在前列腺癌进展中的作用机制;同时研究二甲双胍对IL-6过表达的前列腺癌细胞株增殖、迁移和细胞周期的影响，探索二甲双胍抑制前列腺癌发生发展的相关分子机制。方法：（1）运用慢病毒载体转染技术，构建IL-6过表达的前列腺癌LNCaP细胞株，利用激光共聚焦显微镜观察细胞绿色荧光的表达以明确慢病毒转染情况，在倒置显微镜下观察细胞形态变化;运用ELISA检测IL-6表达水平;运用MTT技术比较IL-6过表达LNCaP细胞（LNCaP-IL-6）与空病毒载体转染的LNCaP细胞(LNCaP-ctr)在比卡鲁胺处理不同时间段的生存率;运用western blot技术比较IL-6过表达的LNCaP细胞和正常LNCaP细胞Twist和E-cadherin蛋白表达;运用RT-PCR技术比较上述蛋白的基因转录水平。（2）加入不同浓度的二甲双胍刺激，运用MTT实验检测不同浓度的二甲双胍对正常LNCaP和IL-6过表达的LNCaP细胞生存率的影响，并选取最佳工作浓度;流式细胞技术检测细胞周期;将LNCaP-IL-6细胞分为二甲双胍处理组与非处理组，运用划痕实验观察细胞迁移，Western blot技术检测Twist和E-cadherin蛋白表达水平，RT-PCR技术检测上述蛋白基因转录水平。结果：（1）LNCaP-IL-6和LNCaP-ctr细胞在激光共聚焦显微镜下均呈现出明显的绿色荧光;在倒置显微镜下观察显示LNCaP-IL-6细胞形态呈纺锤形和星状转变，细胞排列散乱，连接减少，而LNCaP-ctr细胞排列紧密，呈鹅卵石状，与正常LNCaP形态无明显差别;LNCaP-IL-6细胞培养液中IL-6表达水平达到5802±128.09pg/mL，而LNCaP-ctr细胞和正常LNCaP分泌量分别为1.14±0.19pg/mL和1.98±0.84pg/mL;MTT检测结果显示出LNCaP-IL-6细胞的增殖速度及生存力明显优于LNCaP-ctr细胞，P＜0.05;LNCaP-IL-6细胞中Twist mRNA和蛋白表达水平均高于LNCaP-ctr，而E-cadherin mRNA和蛋白表达水平均低于LNCaP-ctr细胞。（2）二甲双胍对LNCaP-IL-6细胞的抑制作用小于对LNCaP-ctr细胞的抑制作用，两者生存率相比P＜0.05，差异具有统计学意义;根据MTT结果，选取2mM的二甲双胍为最适作用浓度;流式细胞术检测结果显示二甲双胍阻滞LNCaP-ctr和LNCaP-IL-6细胞周期的S期;加入2mM二甲双胍处理的LNCaP-IL-6细胞的迁移明显受到抑制。二甲双胍处理组的LNCaP-IL-6细胞Twist表达水平明显低于非处理组，而E-cadherin表达水平较非处理组则明显升高;加入2mM二甲双胍处理后，比较两组细胞中Twist和E-cadherin mRNA的含量，二甲双胍处理组Twist mRNA相对含量较非处理组显著下降，而E-cadherin mRNA水平较非处理组明显升高。结论：（1）IL-6增强LNCaP细胞的增殖和迁移能力，提高LNCaP细胞对雄激素拮抗剂比卡鲁胺的耐药性并增加Twist蛋白和mRNA的表达，降低细胞膜粘附分子E-cadherin的表达;（2）二甲双胍通过阻滞细胞周期抑制前列腺癌细胞的增殖，降低Twist蛋白和mRNA的表达水平，增加细胞表面粘附蛋白E-cadherin的表达，抑制前列腺癌的上皮间质转化和细胞迁移，这可能是二甲双胍发挥抑制前列腺癌效应的重要机制之一。

关键词：前列腺癌白介素-6 二甲双胍慢病毒转染

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CaMKⅡγ的过表达及干扰对大鼠肝部分切除术后肝脏再生的影响

CaMKⅡγ的过表达及干扰对大鼠肝部分切除术后肝脏再生的影响

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作者：周焘昆明医科大学

学位级别：硕士

第一部分大鼠肝部分切除术及慢病毒转染模型的建立[目的]探讨建立SD大鼠肝部分切除及慢病毒转染模型的方法和技巧,为后续肝再生实验研究建立可靠模型基础。[方法]使用2/3肝部分切除术,利用构建的CaMKⅡγ过表达(LV-CaMKⅡγ)、干扰(LV... 详细信息

第一部分大鼠肝部分切除术及慢病毒转染模型的建立[目的]探讨建立SD大鼠肝部分切除及慢病毒转染模型的方法和技巧,为后续肝再生实验研究建立可靠模型基础。[方法]使用2/3肝部分切除术,利用构建的CaMKⅡγ过表达(LV-CaMKⅡγ)、干扰(LV-CaMKⅡγRNAi)及相应空白载体的慢病毒体系,经盲肠静脉分别转染入肝切除术后大鼠体内,并建立空白对照组。五组实验大鼠观察术后并发症,存活,死亡情况,并分别于切肝后1,3,5,7d处死,取肝组织行慢病毒荧光检测;QPCR,Western Blot检测CaMKⅡγ的mRNA和蛋白表达情况;免疫组化检测CaMKⅡγ的表达和组织空间位置情况。[结果]1.利用SD大鼠成功建立2/3部分肝切除术动物模型,术后并发症少,存活率高,大部分建模大鼠能存活到实验设计取肝时间,死亡4只大鼠。2.荧光检测示在LV-CaMKⅡγRNAi感染和其对照慢病毒组中观察到红色荧光,两组荧光表达量随时间增加渐减少;在LV-CaMKⅡγ感染和其对照慢病毒组观察到绿色荧光,两组荧光表达量随时间增加逐渐减少。***检测和Western Blot检测结果,即同一时点LV-CaMKⅡγ组的mRNA和蛋白表达最高,LV-CaMKⅡγRNAi组的mRNA和蛋白表达最低。术后lday,病毒干预组与对应对照组无差异,术后72小时、第5day、第7day,LV-CaMKⅡγ组的表达高于其对照组(*P慢病毒转染肝细胞,有效改变大鼠肝细胞内CaMKⅡγ基因蛋白的表达,达到了实验研究目的,为进一步探讨CaMKⅡγ对肝再生的影响及其机制研究建立模型基础。此建模方法可靠性高,安全性好,可重复性强,且干扰小。第二部分CaMKⅡγ表达变化对大鼠肝切除术后肝再生的影响及机制研究[目的]探究CaMKⅡγ对大鼠肝切除术后肝脏再生能力,肝细胞增殖周期,肝脏合成功能恢复等方面的影响及其机制。[方法]1.使用核磁共振检测大鼠肝体积用于实验动物入组及间接测量切除术后再生肝体积,排水法和MRI法测得肝体积的相关性分析。2.各实验组不同时间点免疫组化法检测肝组织Brdu和PCNA表达情况;免疫荧光法检测Ki67表达情况。3.各实验组不同时间点ELISA法测前白蛋白水平。4.透射电镜观察肝细胞超微结构变化。[结果]1.核磁共振测大鼠肝体积术后1day,各病毒干预组与空白对照组体积无统计学差异(P>0.05)。术后3day、5day、7day,LV-CaMKⅡγ组的体积增长高于其对照组(*P0.05)。排水法(x)和MRI法测得肝体积(y),R=0.992,R2=0.983。直线回归方程为y=0.064+0.879x,二者高度相关。2.不同检测方法,PCNA和Ki67的肝增殖趋势相一致。术后1day,各病毒干预组与空白对照组已有表达但阳性染色率无统计学差异(P>0.05)。术后3day、5day、7day,LV-CaMKⅡγ组的阳性染色率高于其对照组(*P0.05)。Brdu术后3天各组才开始有表达,表达趋势与PCNA和Ki67相一致。3.血清前白蛋白在术后1day,各病毒干预组与空白对照组浓度无统计学差异(P>0.05)。随天数增加浓度升高,以第3天到第5天升高明显,第5天浓度接近正常水平。术后3day、5day、7day,LV-CaMKⅡγ 组浓度高于其对照组(*p0.05)。***术后1天,电镜下con组:线

关键词：大鼠肝再生动物模型 CaMKⅡγ 肝再生慢病毒转染盲肠静脉注射 MRI测大鼠肝体积 PCNA Ki67 Brdu 前白蛋白肝细胞超微结构

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受体介导的HCV入侵小鼠肝癌细胞研究

受体介导的HCV入侵小鼠肝癌细胞研究

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作者：康琼中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是一种经血液传播的RNA病毒,呈全球性流行。全世界有近1.7亿人感染,每年的新发病例约有350万例,感染率约3%。HCV感染机体后会引起急性肝炎,其中约75%以上会转化为慢性肝炎,并逐步发展为肝纤维化、... 详细信息

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是一种经血液传播的RNA病毒,呈全球性流行。全世界有近1.7亿人感染,每年的新发病例约有350万例,感染率约3%。HCV感染机体后会引起急性肝炎,其中约75%以上会转化为慢性肝炎,并逐步发展为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。由于治疗方法有限且缺乏合适的疫苗,使得丙型肝炎防治一直是世界性难题,也引起了众多研究学者的关注。HCV具有严格的种属特异性,只能感染人类和黑猩猩。在实验研究中,由于价格昂贵及伦理等问题难以获得黑猩猩,导致目前还缺乏有效的可用于HCV感染性研究的细胞及动物模型,这也极大阻碍了HCV感染性研究的进程。HCV感染靶细胞是一个由多分子共同作用的复杂过程。大部分研究者认为,介导HCV进入靶细胞的主要受体分子包括低密度脂蛋白受体(Low-Density Lipoprotein Receptor,LDLR)、CD81、B族I型清道夫受体(Scavenger Receptor Class B Type I,SR-BI)、紧密连接区域Claudin-1(CLDN-1)和occludin(OCLN),且CD81和OCLN是HCV进入靶细胞必不可少的两个分子。HCV与低密度脂蛋白(lowdensity lipoprotein,LDL)或者极低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein,VLDL)结合形成复合物(lipoviral particles,LVPs),肝细胞膜表面的葡聚糖氨基聚糖类(glycosaminoglycans,GAGs)和低密度脂蛋白受体LDLR可以使LVPs结合到靶细胞表面,通过膜表面其它的HCV受体分子共同作用,最终经网格蛋白(clathrin)介导的胞吞作用及低p H引发病毒包膜与内体膜的融合,使得HCV衣壳释放,进入胞浆。尽管CD81和OCLN两个分子就可引起病毒进入,但其它受体分子在HCV进入肝细胞时的权重或联合作用能否进一步促进病毒进入还不甚清楚;介导HCV入胞的相关受体分子是如何参与病毒早期感染的也需要进一步探讨。本课题的目的是构建能够体外感染HCV的转基因小鼠肝癌细胞模型,并在细胞模型的基础上进一步研究介导HCV入胞的受体分子在病毒对靶细胞内源化过程中的作用。研究结果如下:一、转基因小鼠肝癌细胞株的筛选。通过慢病毒转染的方法,筛选能够稳定表达HCV多种受体分子的转基因小鼠肝癌细胞株。利用脂质体介导的方法,将串联表达介导HCV感染相关受体分子的重组慢病毒载体和包装质粒共转入包装细胞,包装相应慢病毒;将包装的慢病毒攻击小鼠肝癌细胞系Hepa1-6,荧光活细胞法或加压筛选得到过表达HCV多种膜受体分子的转基因小鼠肝癌细胞株。RT-PCR、激光共聚焦显微镜和免疫印迹均检测到相应受体分子的表达。二、构建的转基因小鼠肝癌细胞株可使HCVpp内源化。利用脂质体介导方法,将构建的表达HCV包膜蛋白和萤火虫荧光素酶的两个重组载体和包装质粒共转入包装细胞,包装病毒HCVpp;用HCVpp病毒孵育转基因细胞,可检测到内源化的HCVpp。三、转基因细胞株SCCO/Hepa1-6和LSCCO/Hepa1-6能使HCV病毒自然感染,且介导HCV入胞的受体分子按照LDLR-SR-BI-CD81和CLDN-1-OCLN的排列顺序更易促进病毒入侵靶细胞。通过HCV阳性血清直接感染实验,证实筛选的转基因细胞株可被HCV病毒自然感染,且LDLR能促进血清病毒进入;利用慢病毒转染的方法筛选出LDLR-CD81-SR-BI和CLDN-1-OCLN串联顺序表达的转基因小鼠肝癌细胞株LCSCO/Hepa1-6;通过比较转基因细胞株LSCCO/Hepa1-6和LCSCO/Hepa1-6对血清中HCV病毒的易感性,发现HCV更易进入LSCCO/Hepa1-6细胞内,这可能与该细胞膜表面的HCV受体分子排列顺序有关,即HCV受体分子的排列顺序对病毒入侵有影响。四、由于HCV存在形式的不同,导致HCVcc感染与病毒自然感染不同,LDLR在HCVcc病毒内源化中所起作用不显著。通过比较两种转基因细胞株SCCO/Hepa1-6和LSCCO/Hepa1-6对HCVcc的结合及进入,未发现LDLR的存在对HCVcc进入有明显的影响;为排除分子串联对其可能存在的影响,使之更接近体内状态,故将串联的重组慢病毒载体进行改构并构建单分子表达的慢病毒载体;经脂质体转染细胞系Hepa1-6后孵育HCVcc,检测细胞内HCV RNA拷贝数,发现,各受体分子单独表达与串联表达时,病毒内源化基本一致;考虑到病毒自然感染与HCVcc感染时病毒存在形式不同,以及不同病毒入胞与其结合的受体分子也不同,故将LDLR和SR-BI对HCVcc进入靶细胞过程的作用做了比较;发现,SR-BI是HCVcc感染的必

关键词：丙型肝炎病毒慢病毒转染细胞模型 LDLR SR-BI CD81

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基于荧光报告基因分选前列腺癌基底和腔细胞新方法的建立

基于荧光报告基因分选前列腺癌基底和腔细胞新方法的建立

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作者：李星天津医科大学

学位级别：硕士

目的:建立一种基于荧光报告基因的分选前列腺癌基底细胞和腔细胞的新方法,为后续前列腺癌细胞起源及相关研究提供基础。方法:构建包含目的启动子的荧光报告基因,慢病毒法转染前列腺癌LNCa P细胞系,利用流式细胞分选仪分选转染后细胞,得... 详细信息

目的:建立一种基于荧光报告基因的分选前列腺癌基底细胞和腔细胞的新方法,为后续前列腺癌细胞起源及相关研究提供基础。方法:构建包含目的启动子的荧光报告基因,慢病毒法转染前列腺癌LNCa P细胞系,利用流式细胞分选仪分选转染后细胞,得到基底细胞和腔细胞。对分选后细胞进行westernblot及Q-PCR验证。结果:1.慢病毒法成功转染LNCaP细胞,并分选出基底细胞和腔细胞。***及Q-PCR验证相应的分选后细胞,符合预期结果。结论:利用荧光报告基因和流式细胞分选来得到基底细胞和腔细胞的方法是可行的。

关键词：前列腺癌基底细胞腔细胞 LNCaP细胞荧光报告基因慢病毒转染流式细胞分选

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GSPT2在肝癌患者中的表达水平及分子流行病学研究

GSPT2在肝癌患者中的表达水平及分子流行病学研究

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作者：王璐瑶河北医科大学

学位级别：硕士

第一部分GSPT2在肝癌组织中的表达及预后分析目的:研究GSPT2基因在肝癌及癌旁组织中的表达差异及与临床病理特征和预后的关系。方法:免疫组织化学染色检测46对肝癌组织及对应癌旁组织GSPT2基因表达量,采用H-score对GSPT2基因进行半定量... 详细信息

第一部分GSPT2在肝癌组织中的表达及预后分析目的:研究GSPT2基因在肝癌及癌旁组织中的表达差异及与临床病理特征和预后的关系。方法:免疫组织化学染色检测46对肝癌组织及对应癌旁组织GSPT2基因表达量,采用H-score对GSPT2基因进行半定量分析;采用qRT-PCR及Western blot检测本室留存的3对肝癌及癌旁组织标本中GSPT2基因mRNA和蛋白表达量。SPSS21.0进行卡方检验分析GSPT2基因表达量差异与临床病理特征的关系;进行Kaplan-Meier法及Log-rank检验法分析GSPT2基因表达与总生存期(Overrall Survival,OS)和无瘤生存期(Desease-Free Survival,DFS)的关系;拟合多因素Cox模型,采用HR(Hazard Risk,HR)及95%CI估计不同临床因素与肝癌死亡结局是否有联系。挖掘TCGA数据库,分析数据库中亚洲肝细胞癌患者及正常人GSPT2基因表达量差异及与预后关系。结果:1免疫组化结果显示肝癌患者GSPT2基因表达量中位数11.36低于正常人中位数24.51(P转染7402肝癌细胞和HepG2肝癌细胞,qRT-PCR检测转染后细胞内GSPT2基因mRNA表达量,转染48h后流式细胞术检测细胞周期的变化;划痕实验检测细胞划痕迁移能力差异。构建GSPT2基因稳定过表达的HepG2肝癌细胞,实时荧光定量和蛋白印迹法检测GSPT2基因mRNA和蛋白的表达情况;用CCK8法检测细胞活力来验证细胞增值能力变化;流式细胞术检测GSPT2基因过表达后细胞周期和凋亡能力变化;Transwell细胞侵袭实验来检测侵袭能力变化;细胞划痕实验来检测细胞迁移能力的变化。结果:1瞬时转染48h收取细胞qRT-PCR结果显示GSPT2基因在7402肝癌细胞和HepG2肝癌细胞中表达较对照组高(P<0.001),证明74

关键词： GSPT2基因肝癌预后 HepG2细胞慢病毒转染分子流行病学

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MSCs-CM抗TGF-β1诱导NRK-49F纤维化机制研究及与Galectin-3基因的相关性观察

MSCs-CM抗TGF-β1诱导NRK-49F纤维化机制研究及与Galectin-3基因...

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作者：张霈玥西南医科大学

学位级别：硕士

目的:观察自制骨髓源性间充质干细胞条件培养基（Bone marrowderived Mesenchymal Stem Cells Conditional Medium,MSCs-CM）对转化生长因子β1（Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1）诱导大鼠肾间质成纤维细胞（NRK-49F）纤维化的影响,初步探讨其影响机制及其同半乳糖凝集素-3（Galectin-3,Gal-3）基因表达的相关性。方法:1.建立不同Gal-3表达水平的大鼠肾间质成纤维细胞株:购买NKR-49F并传代,运用了慢病毒载体,借助蛋白免疫印迹（Western Blot）检测和验证,同时成功建立了Gal-3敲低、过表达的两种NKR-49F细胞株,备用。2.大鼠MSCs原代分离培养与表型鉴定:首先,取青年雄性SD大鼠,在无菌条件下,用生理盐水将两侧股骨和胫骨骨髓冲出,收集冲洗液并离心,弃上清液。其次,用MSCs专用培养基重悬沉淀物,接种于T25的培养瓶中。48 h后更换新鲜培养基,每隔3天换液一次,直至90%细胞融合后,获得原代MSCs,用于传代和表型鉴定。最后,按照1:3比例体外传代,至P3代时,进行流式细胞表型鉴定,阳性指标CD29、CD90,阴性指标CD34、CD45。***条件培养基（MSCs-CM）收集:将原代MSCs细胞体外传代至P3代时,换用无血清专用培养基培养,48 h后收集上清液,离心去除细胞后,获得MSCs-CM并通过小份分装法,冻存于﹣80℃冰箱。4.细胞实验分组及处理方法:细胞实验分为正常对照组（Con）、TGF-β1模型组（TGF-β1）、基础培养基对照组（TGF-β1+MEM）、MSCs-CM干预组（TGF-β1+MSCs-CM）、单纯MSCs-CM组。TGF-β1模型组用人源重组TGF-β1（10 ng/m L）的含5%FBS的MEM完全培养基,连续处理24 h诱导纤维化模型。MSCs-CMs干预组是在TGF-β1处理细胞24 h后,再用MSCs-CM连续处理24 h。基础培养基对照组是在诱导纤维化后,再加无血清的MEM基础培养基培养24 h。单纯MSCs-CM组是直接用MSCsCM处理细胞24 h。5.细胞纤维化标志及检测方法:首先,收集各组细胞后,分别提取蛋白,Western Blot法检测肌成纤维细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth Muscle Actin,α-SMA）、纤维化早期生物标志蛋白Gal-3和细胞外基质标志蛋白成分的表达水平。其次,运用ELISA方法,检测各组上清中的Gal-3水平。***-β1/Smad信号通路关键蛋白质表达检测:运用Western Blot法,检测该通路TGF-β1、p-smad2/3与Smad2/3等蛋白质表达水平。7.细胞因子芯片检测:分别取各组的细胞上清液,利用AAR-BLG-90（8）细胞因子芯片,检测各组细胞因子的谱系变化。结果:***呈短梭形成纤维细胞样漩涡贴壁生长,流式细胞表型鉴定显示阳性指标CD29和CD90均在95%以上表达,成骨和成脂诱导分化显示在专用诱导培养基作用下呈典型的矿化结节和大量大小不一红色脂滴。***-β1 10 ng/mL处理24 h能够诱导NRK-49F细胞α-SMA、Gal-3、FN、TGF-β1,p-smad2/3与smad2/3比值均较正常组显著增加（p＜0.05）,建模后无血清MSCs-CM处理24 h后细胞内α-SMA、Gal-3、FN、TGF-β1以及p-smad2/3与smad2/3比值均较模型组显著下调（p＜0.05）,上清中Gal-3水平变化与胞浆中蛋白表达变化基本一致。***-CM干预组和单独的MSCs-CM干预组比较无显著差异。细胞因子谱系检测显示TGF-β1处理24 h能上调白介素家族成员如IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-5、IL-10、IL-13、肿瘤坏死因子及受体超家族TNF-α、FADD,趋化因子如CD106、CINC-2α/β、CINC-3、CXCR4等,和转化生长因子TGF-β1、TGF-β3、干扰素IFN-γ、基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-8、MMP-13以及MMPs组织抑制物TIMP-2、TIMP-3和IntegrinαM,β2。MSCs-CM处理后,它们表达呈一定程度的下调。由于样本量不足,达不到统计学要求。4.与对照组相比,NRK-49F细胞中敲低和过表达Gal-3后,TGF-β1均能够显著增加细胞中α-SMA和FN蛋白表达（p＜0.05）。MSCs-CM干预24 h后均可降低α-SMA表达（p＜0.05）,与Gal-3基因表达无明显相关性。敲低Gal-3基因细胞较过表达Gal-3细胞,基础培养基MEM干预时更能促进自身修复。

关键词：肾脏纤维化半乳糖凝集素3 间充质干细胞的条件培养基慢病毒转染

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不同诱导方式对Scleraxis基因转染hAMSCs向韧带细胞分化的差异性研究

不同诱导方式对Scleraxis基因转染hAMSCs向韧带细胞分化的差异性...

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作者：钱地坤遵义医科大学

学位级别：硕士

目的:探究CTGF联合人前交叉韧带成纤维细胞Transwell共培养体系对ScxhAMSCs体外向韧带细胞分化的影响。方法:1)通过酶消化法从胎盘羊膜上分离出hAMSCs并进行传代培养,取传至第3代的hAMSCs进行细胞表型鉴定,检测hAMSCs向骨、软骨及脂细... 详细信息

目的:探究CTGF联合人前交叉韧带成纤维细胞Transwell共培养体系对ScxhAMSCs体外向韧带细胞分化的影响。方法:1)通过酶消化法从胎盘羊膜上分离出hAMSCs并进行传代培养,取传至第3代的hAMSCs进行细胞表型鉴定,检测hAMSCs向骨、软骨及脂细胞定向分化的能力。运用酶消化法从人前交叉韧带残端分离出hACLFs,免疫荧光染色检测I型胶原、III型胶原表达情况;通过CCK-8法比较hAMSCs与hACLF的增殖能力。2)将目标质粒和对照质粒共同转染到HEK293T细胞,包装慢病毒后进行浓缩,进行滴度测定后对第3代hAMSCs进行转染,q PCR及Westen Blot对转染后的细胞进行Scx过表达验证。3)联合使用CTGF及Transwell共培养体系进行诱导分化,按不同培养方案分为6组:(A)hAMSCs经CTGF诱导组、(B)hAMSCs+hACLFs Transwell共培养组、(C)Scx-hAMSCs组、(D)Scx-hAMSCs经CTGF诱导组(E)ScxhAMSCs+hACLFs Transwell共培养组(F)Scx-hAMSCs经CTGF诱导+hACLFs Transwell共培养组。共培养组中两组细胞密度比为1:1。CCK-8法测定各组细胞增殖能力,分别于7、10、14天时对各组细胞的韧带相关基因和蛋白表达进行检测。结果:1)运用酶消化法得到的hAMSCs数目多,呈梭形贴壁生长,旋转排列;细胞表型符合间充质干细胞的细胞表型特点,经定向诱导后可成骨、软骨、脂细胞分化,具备三系分化能力,符合MSCs特点。酶消化法提取的原代hACLFs数目较少,经传代扩增后呈长梭型规则排列;免疫荧光染色结果提示有Ⅰ、Ⅲ型胶原表达;CCK-8检测结果表明hAMSCs体外增殖能力明显强于hACLFs,差异具有统计学意义(P转染系统,感染HEK293T细胞,包装成慢病毒。将慢病毒浓缩后感染hAMSCs,q PCR和Westen Blot结果均显示Scx过表达组细胞中SCX表达显著高于空载组(P慢病毒载体可将Scx基因转染至hAMSCs,并在宿主细胞中过表达。3)CTGF与Transwell共培养系统在促进hAMSCs向韧带细胞分化上具有协同作用,二者联合使用效果优异;其中CTGF在维持细胞活性、促进细胞增殖方面效果更好,Transwell共培养在诱导细胞分化上作用更强。

关键词：人羊膜间充质干细胞人前交叉韧带成纤维细胞 Scleraxis 慢病毒转染共培养结缔组织生长因子

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FADS2基因在食管鳞状细胞癌中的表达及其生物学功能的初步探究

FADS2基因在食管鳞状细胞癌中的表达及其生物学功能的初步探究

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作者：王玲玲郑州大学

学位级别：硕士

研究背景和目的食管癌是人类常见的消化道恶性肿瘤之一,死亡率在所有肿瘤中排名第四[1],病理类型分为鳞癌和腺癌,在我国食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是最主要的病理类型,其发病率具有明显的地区差异和家族... 详细信息

研究背景和目的食管癌是人类常见的消化道恶性肿瘤之一,死亡率在所有肿瘤中排名第四[1],病理类型分为鳞癌和腺癌,在我国食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是最主要的病理类型,其发病率具有明显的地区差异和家族聚集现象,其高发区位于东亚以及中国东部地区,特别是河南的林州、安阳、辉县和大别山区等地。当前的肿瘤分子生物学研究资料表明,环境、遗传和精神心理等因素通过协同或序贯的方式引起DNA损伤,使抑癌基因失活或者使原癌基因激活,加上凋亡调节基因或者DNA修复基因的异常改变,促使正常的食管粘膜经过一个多因素、多基因、多阶段的恶性演化过程,由此发展为食管癌[2],据此,从DNA修复基因、原癌基因、抑癌基因、代谢酶基因的遗传多态性入手研究易感基因及肿瘤标志物可以为食管癌的早期诊断、治疗及预后提供更多的理论依据[3]。有研究发现在乳腺癌组织中脂肪酸去饱和酶基因2(Fatty Acid Desaturase 2,FADS2)表达水平增高,促进亚油酸(linoleic acid,LA)转化成二十碳四烯酸(arachidonic acid,AA),同时其代谢产物前列腺素E2(Prostagland E2,PGE2)增多,在乳腺癌的发生发展中起到一定的促进的作用[4],在食管鳞癌中该基因表达水平显著上调,其机制尚不清楚。本文通过相关实验,检测FADS2基因在ESCC及癌旁正常黏膜组织中mRNA及蛋白的表达情况,分析其与患者临床病理特征和预后的关系;通过慢病毒转染系统构建稳定表达FADS2的细胞克隆,进行体外细胞增殖实验、软琼脂克隆形成实验、平板克隆形成实验、细胞迁移和侵袭实验初步探讨其生物学功能。研究方法1.临床标本的收集从河南省林州市人民医院收集手术切除的ESCC新鲜组织标本,每例标本包含食管鳞癌组织及癌旁组织,共70对,储存于液氮中,用于提取组织RNA,检测FADS2 mRNA的表达。另外,本课题组调取了河南省林州市人民医院299例ESCC根治切除术的石蜡包埋组织样本,整理临床病理和随访资料,制作ESCC的组织芯片。2.方法通过QPCR方法检测FADS2 mRNA在70例ESCC及癌旁相对正常粘膜组织标本中的表达情况;通过免疫组织化学方法检测FADS2蛋白在299对ESCC组织芯片中的表达水平,并分析FADS2的表达与ESCC患者临床病理特征和预后的相关性。通过慢病毒包装系统将FADS2表达质粒分别转染到食管癌细胞株KYSE30和KYSE510中,筛选出稳定表达FADS2的细胞,并用QPCR、Western blot鉴定。通过体外的细胞增殖实验、平板克隆形成实验、软琼脂克隆形成实验、迁移实验和侵袭实验研究FADS2对细胞生长、克隆形成、迁移及侵袭能力的影响。研究结果***方法检测FADS2在食ESCC及其相对应的癌旁正常粘膜组织中的表达,统计学结果显示FADS2 m RNA在ESCC组织中呈现高表达现象,而在癌旁组织中呈现相对低表达现象,且在ESCC组织和癌旁组织中的表达水平差异具有统计学意义(p0.05)。Kaplan-Meier分析结果表明,FADS2高表达组(n=79)与正常表达组(n=129)的生存曲线有显著差异,FADS2高表达患者的中位生存时间18个月,FADS2正常表达患者的中位生存时间27个月,二者差异有统计学意义(P<0.05)。3.通过体外细胞功能实验,我们发现过表达FADS2基因的食管癌细胞系KYSE30和KYSE510的增殖、非锚定克隆形成能力增强;同时,细胞迁移实验和侵袭实验显示FADS2能够促进细胞的迁移和侵袭。结论***2在食管鳞癌组织中呈现阳性表达,且在癌组织中的表达量高于相对应的癌旁组织,其高表达与患者的淋巴结转移及临床分期有关,是预后不良的重要因素。***2的高表达会导致肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和非锚定克隆形成能力增强。

关键词：食管鳞癌 FADS2 预后慢病毒转染侵袭和转移

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