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烟夜蛾性信息素结合蛋白2和谷胱甘肽S-转移酶基因的表达模式与原核表达

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烟夜蛾性信息素结合蛋白2和谷胱甘肽S-转移酶基因的表达模式与原...

作者：李亮河南农业大学

学位级别：硕士

昆虫识别挥发性气味分子的灵敏性和特异性对其生存和繁殖起着重要作用,这个过程包括对气味分子的结合、接受、把化学信号转化为电信号的信号转导、信号终止等步骤,有多种蛋白相互作用共同完成。性信息素结合蛋白(pheromone binding prot... 详细信息

昆虫识别挥发性气味分子的灵敏性和特异性对其生存和繁殖起着重要作用,这个过程包括对气味分子的结合、接受、把化学信号转化为电信号的信号转导、信号终止等步骤,有多种蛋白相互作用共同完成。性信息素结合蛋白(pheromone binding proteins, PBPs)能选择性识别结构非常相似的性信息素成分,而谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)具有使醛类物质特别是性信息素信号终止的作用,因此,PBPs和GSTs在昆虫雌雄间信息交流中都具有重要的作用,并承担着不同的功能。本文对烟夜蛾Helicoverpa assulta PBPs和GSTs基因进行了克隆、表达模式及原核表达研究,期望为进一步分析和探明烟夜蛾雌雄间的信息交流机制提供依据。主要研究结果如下:(1)利用RT-PCR和RACE方法,从烟夜蛾雄虫触角中克隆了PBP2基因的开放阅读框及3′末端序列,该基因被命名为HassPBP2(GenBank登录号为EU316186)。克隆和测序结果表明,HassPBP2开放阅读框全长450bp,编码149个氨基酸残基,推测编码蛋白的分子量为16.9kD,等电点为5.56。HassPBP2基因结构分析表明,该基因由3个外显子和2个内含子组成,内含子的长度分别为90bp和261bp。氨基酸序列联配分析表明,此序列具有气味结合蛋白的典型特征,与其他鳞翅目昆虫PBPs的一致性在34%-91%之间,其中与棉铃虫Helicoverpa armigera PBP2和烟芽夜蛾Heliothis virescens PBP2的序列一致性高达91%。(2)利用跨内含子引物和半定量RT-PCR方法,研究了HassPBP2在烟夜蛾不同发育期和组织内的表达情况。结果表明,HassPBP2在卵期、幼虫期和蛹早期不表达,在蛹中期开始表达,并一直持续到成虫中后期,且只在雌雄成虫触角中表达。(3)成功构建了HassPBP2的原核表达载体pGEX-HassPBP2,导入大肠杆菌BL21(DE3)细胞中,经过IPTG诱导以及SDS-PAGE分析,结果表明融合蛋白得到了成功表达。(4)利用RT-PCR和RACE方法,从烟夜蛾雄虫触角中克隆了获得了1个谷胱甘肽S-转移酶基因的全长cDNA序列(GenBank登录号为EU289223)。克隆和测序结果表明,该基因开放阅读框全长654bp,编码217个氨基酸残基,推测编码蛋白的分子量为24.8KD,等电点为7.76。基因结构分析表明,该基因由6个外显子和5个内含子组成,内含子的长度分别为415bp、513bp、296bp、333bp和269bp。将该基因推导的氨基酸序列与其他物种的GSTs进行同源性和系统发育分析,发现该基因编码的蛋白属于昆虫特异性Epsilon家族成员,将该基因命名为HaGSTe1。(5)利用跨内含子引物和半定量RT-PCR方法,研究了HaGSTe1在烟夜蛾不同发育期和组织内的表达情况。结果表明,HaGSTe1在幼虫中期、晚期,蛹晚期和成虫期均表达,而在卵、幼虫早期和蛹早期、中期不表达;在雌、雄成虫的触角和喙中表达。并成功构建了HaGSTe1的原核表达载体pGEX-HassGSTe1。(6)利用RT-PCR方法,从烟夜蛾成虫腹部克隆获得了另1个谷胱甘肽S-转移酶基因的完整开放阅读框的cDNA序列(GenBank登录号:GQ856239)。该基因的开放阅读框全长636bp,编码211个氨基酸残基,推测编码蛋白的分子量为24.2kD,等电点为6.66。将该基因推导的氨基酸序列与其他物种的GSTs进行同源性和系统发育分析,发现该基因编码的蛋白属于昆虫特异性Epsilon家族成员,将该基因命名为HaGSTe2。(7)利用半定量RT-PCR方法,研究了HaGSTe2在烟夜蛾不同发育期和组织内的表达情况。结果表明,HaGSTe2在雌、雄虫触角、喙、去除触角和喙的头、胸、腹、足和翅中均有表达,而且在卵、幼虫和蛹中也有表达。

关键词：烟夜蛾性信息素结合蛋白谷胱甘肽-S转移酶基因克隆序列分析表达模式原核表达

长足大竹象性信息素结合蛋白CbuqPBP1与CbuqPBP2互作机制研究

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长足大竹象性信息素结合蛋白CbuqPBP1与CbuqPBP2互作机制研究

作者：王帆四川农业大学

学位级别：硕士

长足大竹象Cyrtotrachelus buqueti是我国丛生竹(笋)的主要钻蛀性害虫,其危害严重制约竹产业发展,因此需开展相应防治。利用昆虫信息素进行长足大竹象绿色防控可弥补现有防治策略不足。但信息素的开发依赖于昆虫嗅觉感受机制对于环境气... 详细信息

长足大竹象Cyrtotrachelus buqueti是我国丛生竹(笋)的主要钻蛀性害虫,其危害严重制约竹产业发展,因此需开展相应防治。利用昆虫信息素进行长足大竹象绿色防控可弥补现有防治策略不足。但信息素的开发依赖于昆虫嗅觉感受机制对于环境气味物质的识别,因此需要探究嗅觉蛋白之间相互作用,揭示觅偶行为中的嗅觉感受机制。基于前期实验室已经克隆表达出两个性信息素结合蛋白CbuqPBP1、CbuqPBP2,本实验研究两种性信息素结合蛋白PBP1与PBP2间的相互作用,解析其补偿效应,从空间构象上分析复合蛋白的结合能力,揭示长足大竹象的信息感受机理,为实现利用信息物质对长足大竹象种群持续控制奠定理论基础。研究结果如下:1、以CbuqPBP2蛋白为诱饵蛋白进行GST pull-down实验并结合质谱分析筛选互作蛋白。除去GST对照组鉴定的蛋白后,共得到45个潜在互作蛋白,其中有代表性的为CbuqPBP1、ND2、CYTB。互作蛋白生物信息学分析结果表明CbuqPBP2可能会参与能量代谢和运输分解代谢等过程。2、成功构建了p GADT7-PBP1重组猎物质粒与p GBKT7-PBP2重组诱饵质粒。诱饵质粒毒性检测和自激活检测表明对Y2HGold酵母菌无毒性作用,添加5 mmol/L 3’AT可以抑制诱饵激活HIS3报告基因。共转化验证实验结果显示其酵母菌株在TDO培养基上能够生长,表明CbuqPBP2能与CbuqPBP1互作。通过GST Pull-down和酵母双杂实验,分别在体外和酵母细胞内证实了CbuqPBP2和CbuqPBP1存在特异性互作。3、荧光竞争实验表明CbuqPBP1/CbuqPBP2二元混合蛋白配体结合范围更广,推测CbuqPBP1与CbuqPBP2间可能有补偿效应,表现为二元混合蛋白中任意蛋白对配体具有结合能力,二元混合蛋白则与配体结合。二元混合蛋白与(E,E)-2,4-壬二烯醛结合能力高于单一蛋白的结果说明CbuqPBP1与CbuqPBP2会通过互作识别某些信息素物质,进而加强对某些信息素的识别能力,使其更好的与之结合。4、对CbuqPBP2进行了同源建模,其三维结构具有一般气味结合蛋白的特点。通过ZDOCK蛋白对接预测了CbuqPBP1/CbuqPBP2复合物模型,分析了蛋白复合物界面相互作用力,CbuqPBP1/CbuqPBP2蛋白复合物之间的相互作用力有氢键、Pi相互作用、盐键等,其中氢键作用是主要作用。同时预测CbuqPBP2氨基酸残基LYS102、LYS107、LYS120、GLN124、ASP55、ASP57、PHE53和CbuqPBP1氨基酸残基VAL114、MET75、ASP73、GLN107、CYS110、ARG91、SER108是CbuqPBP1/CbuqPBP2复合物产生相互作用的主要氨基酸。5、复合物分子对接结果表明与单一蛋白结合相比,复合物氢键数量或者键长会发生改变,使复合物与配体的结合能力发生变化,而氢键变化可能与蛋白质复合物结合区域构象的变化有关。复合蛋白与配体相互作用表明,氢键、疏水作用和范德华力均有参与,其中能与之形成氢键的氨基酸可能为关键作用位点。

关键词：长足大竹象性信息素结合蛋白蛋白互作 CbuqPBP1和CbuqPBP2蛋白复合物分子对接

朱红毛斑蛾性信息素结合蛋白的克隆与结合分析

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朱红毛斑蛾性信息素结合蛋白的克隆与结合分析

作者：陈炼广西大学

学位级别：硕士

昆虫性信息素结合蛋白(pheromone binding proteins,PBPs)可识别和运输性信息素分子,是嗅觉参与两性交流的第一步。研究PBPs的分子功能及与性信息素分子的结合机制,为性信息素引诱剂和PBPs干扰剂的研制奠定基础。朱红毛斑蛾Phauda flamm... 详细信息

昆虫性信息素结合蛋白(pheromone binding proteins,PBPs)可识别和运输性信息素分子,是嗅觉参与两性交流的第一步。研究PBPs的分子功能及与性信息素分子的结合机制,为性信息素引诱剂和PBPs干扰剂的研制奠定基础。朱红毛斑蛾Phauda flammans(Walker)是榕属植物上的重要食叶害虫。成虫日行性,以幼虫取食榕属植物叶片,在南亚和东南亚多国多地暴发危害。本研究构建了朱红毛斑蛾触角转录组Unigene基因库;筛选出3种不同条件下稳定表达的内参基因;分析了Pfla PBP1和Pfla PBP2的组织表达特性;探究了Pfla PBP1和Pfla PBP2与2种性信息素组分[顺式-9-十六烯醛和(Z,Z,Z)-9,12,5-十八碳三烯醛]的结合能力与结合方式。研究结果可为明确朱红毛斑蛾性信息素结合蛋白的作用机制及设计新型防控技术提供参考依据。主要研究结果如下:(1)朱红毛斑蛾触角转录组测序与内参基因的筛选。本研究利用Illumina构建了朱红毛斑蛾触角转录组数据库、采用q RT-PCR技术筛选了有效内参基因。经测序组装共获得28,508,222条clean reads,67,253条Unigenes;通过4大数据库比对注释,得到26,422条注释Unigenes;Nr数据库比对同源物种发现,其与脐橙螟Amyelois transitella Walker和家蚕Bombyx mori Linnaeus的亲缘关系更近;KOG聚类分析将12,830条Unigenes分为25个类群;GO聚类分析将11,042条Unigenes分为3大功能。基于触角转录组,利用BLAST比对得到朱红毛斑蛾共有20个气味结合蛋白(odorant binding proteins,Pfla OBPs),根据其功能分为15个Pfla OBPs,2个普通气味结合蛋白(general odorant binding protein,Pfla GOBPs),1个触角结合蛋白(antennal binding proteins,,Pfla ABPX)和2个性信息素结合蛋白(pheromone binding proteins,Pfla PBPs)。实时荧光定量PCR技术(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)筛选出朱红毛斑蛾在不同成虫组织、不同成虫性别和不同发育阶段3个条件下的有效内参基因,在不同成虫组织基因定量研究中,建议以TUB2和GAPDH作为内参基因;在不同成虫性别基因定量研究中,建议以TUB1和EF1α作为内参基因;在不同发育阶段基因定量研究中,建议以ACTIN3和TBP作为内参基因。基于Ge Norm分析,最佳内参基因使用数目为2个。转录组数据库构建和有效内参基因筛选为后续朱红毛斑蛾性信息素结合蛋白的分子调控机制研究提供了有效数据平台。(2)朱红毛斑蛾性信息素结合蛋白基因的克隆与组织表达。本研究基于朱红毛斑蛾触角转录组测序获得相关气味蛋白的基础上,成功克隆获得了2个完整的朱红毛斑蛾Pfla PBPs(Pfla PBP1和Pfla PBP2)基因,其登录号分别为MK948015和MK948014。基于进化树分析表明,Pfla PBPs与其它鳞翅目昆虫的PBPs高度同源。其中,Pfla PBP1与螟蛾科昆虫具有较高的同源性,Pfla PBP2与蝶类昆虫具有较高同源性。多重序列比对发现,Pfla PBPs与其它鳞翅目PBPs一样均含有6个典型的Cys。此外,q RT-PCR分析表明,Pfla PBPs在朱红毛斑蛾各组织(触角、头、胸、腹、足和翅)中均有分布,但在触角中含量最多。同时,Pfla PBPs在触角中存在差异性表达,Pfla PBP1偏向雄性表达,Pfla PBP2在偏雌性表达,且均存在显著性差异。(3)朱红毛斑蛾性信息素结合蛋白的外源表达纯化与结合分析。利用大肠杆菌原核表达系统在体外成功表达出Pfla PBP1和Pfla PBP2蛋白,并利用镍柱亲和层析,去除6*His标签,得到纯化的Pfla PBP1和Pfla PBP2蛋白。Pfla PBP1-2与2种性信息素组分的荧光竞争结合实验表明,Pfla PBP1与顺式-9-十六烯醛和(Z,Z,Z)-9,12,5-十八碳三烯醛2种性信息素组分都具有结合能力,Pfla PBP2仅与(Z,Z,Z)-9,12,5-十八碳三烯醛具有结合能力。Pfla PBP1-2的6个半胱氨酸Cys,两两形成二硫键,连接7个α-螺旋,形成Pfla PBP1-2蛋白的三维结构;与2个性信息素分子对接后发现,Z-9-十六烯醛与Pfla PBP1的Leu 169和Ile170 2个位点结合;(Z,Z,Z)-9,12,15-十八碳三烯醛与Pfla PBP1的Ile 170位点结

关键词：朱红毛斑蛾性信息素结合蛋白基因表达荧光竞争结合分子对接

桃小食心虫性信息素结合蛋白基因的克隆及功能鉴定

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桃小食心虫性信息素结合蛋白基因的克隆及功能鉴定

作者：田志强中国农业科学院

学位级别：硕士

桃小食心虫是我国北方果树生产中发生与危害最为广泛的食心虫类害虫之一,由于具有分布广、隐蔽性强、自然天敌少等特点难以防治。生产中主要通过化学农药等措施来控制其为害,但在综合防治措施中,由于性诱剂等引诱剂具有高效、专一性、... 详细信息

桃小食心虫是我国北方果树生产中发生与危害最为广泛的食心虫类害虫之一,由于具有分布广、隐蔽性强、自然天敌少等特点难以防治。生产中主要通过化学农药等措施来控制其为害,但在综合防治措施中,由于性诱剂等引诱剂具有高效、专一性、不伤害益虫、不污染环境等优点,被广泛应用。性信息素和寄主挥发物在害虫的引诱过程中扮演着重要的角色,昆虫利用其灵敏的嗅觉系统定位寄主食物和栖息场所、探求配偶、交配并产卵、躲避天敌等,而寄主挥发物与性信息素的结合使用能够显著增强引诱剂的效果。因此,本文对桃小食心虫的嗅觉相关蛋白展开研究,并着重调查在雌雄之间的差异基因,从而为进一步开发高效的桃小食心虫性诱剂、控制其种群数量奠定理论基础。首先对桃小食心虫雌雄触角进行了二代转录组测序,通过同源比对等生物信息学方法等注释并鉴定了嗅觉基因家族,然后着重研究了性信息素结合蛋白(pheromone binding proteins,PBPs)和普通气味结合蛋白(general odorant binding proteins,GOBPs)的表达模式和功能。主要研究结果如下:1.桃小食心虫触角转录组测序及嗅觉基因的鉴定本研究使用Illumina HiSeq4000平台对桃小食心虫雌雄触角进行了转录组测序,并通过生物信息学对嗅觉识别相关基因进行鉴定,共鉴定了 29个OBPs基因、13个CSPs和52个气味受体基因(包括1个Orco)。OBPs的氨基酸多重序列比对结果表明其中19个具有OBPs的典型特征。另外,除了 5个OBPs(OBP1、OBP4、OBP9、OBP20、OBP22)外,其余OBPs均具有信号肽。进化树分析结果表明,桃小食心虫的GOBP3聚到了 GOBP1亚家族,而进一步同源矩阵分析发现GOBP3与其他昆虫的GOBP1有较高的一致性,平均一致性为65.2%,表明GOBP3可能与GOBP1有着类似的生物功能;荧光定量结果显示OBP7特异性地在雌雄触角中表达,表明其可能在桃小识别性信息素、定位寄主植物和寻找合适产卵位点的过程中发挥重要作用;而其余OBPs(OBP7、OBP9、OBP12、OBP15、OBP19、GOBP1、GOBP3、PBP2)除了在触角中高表达外,在其他组织中也有表达。本研究所鉴定的13个CSPs均有CSPs序列motif(C1-X6-8-C2-X16-21-C3-X2-C4),即具有4个保守的半胱氨酸。另外,信号肽预测发现13个CSPs均具有完整的ORF,且均编码信号肽序列。荧光定量结果表明在我们鉴定的3个CSPs(CSP1、CSP5、CSP12)中只有CSP5在触角中特异性高表达,表明CSP5可能在桃小嗅觉识别过程中发挥关键作用;值得注意的是CSP1和CSP12均在雄虫的腹中高表达,表明其可能在桃小的生长发育中发挥重要功能。对受体基因的跨膜结构域分析结果显示52个ORs的跨膜结构为2-7个,信号肽预测发现其均为信号肽结构。荧光定量检测了 14个ORs(OR3、OR4、OR8、OR17、OR21、OR24、OR30、OR31、OR33、OR34、OR41、OR46、OR48、OR49)的表达谱,结果表明ORs不仅在触角中高表达,在其它组织中也有表达。其中9个ORs(OR4、OR17、OR21、OR24、OR34、OR46、OR48、OR49、GR8)在雌虫触角中的表达量显著高于雄虫触角中,表明这几个基因对桃小雌蛾定位寄主植物和寻找产卵位点的过程有着重要作用;4个ORs(OR8、OR30、OR31、OR33)在雄虫触角中显著性高表达,表明其可能在识别性信息素过程中起关键作用。***和GOBPs基因的分子克隆及功能分析首先通过RACE-PCR分子克隆得到PBPs和GOBPs基因,同时qRT-PCR转录水平和western蛋白水平检测结果表明,PBPs和GOBPs基因在桃小雄虫触角中的表达量均显著高于雌虫。荧光竞争结合实验结果表明,CsasPBP1和CsasPBP3主要识别Z-7-二十碳烯-11-酮,而CsasPBP2则主要负责识别Z-7-十九碳烯-11-酮,而除GOBP2外其余4个蛋白均与桃小的2种性信息素组分(Z-7-eicosene-11-one 和 Z-7-nonadecene-11-one)具有很强的结合能力,而只有 CsasPBP3 特异性地结合性信息素成分,CsasPBP1-2能够与众多的苹果挥发物发生结合;GOBP1-2可以与寄主挥发物发生特异性结合。值得注意的是它们均与酯类化合物和烯类化合物有较强的结合能力,进一步分析发现这5个蛋白与6-7个碳原子的化合物结合力较弱。这表明碳链上的不饱和双键存在以及碳链的长度与否显著地影响了化合物分子与蛋白的结合能力。

关键词：桃小食心虫触角性信息素结合蛋白普通气味结合蛋白性信息素

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对二化螟性信息素结合蛋白基因功能的研究

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利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对二化螟性信息素结合蛋白基因功能...

作者：董筱桐南京农业大学

学位级别：硕士

CRISPR/Cas9基因编辑系统是由细菌和古细菌抵御外源核酸入侵时的获得性免疫机制发展而来的一项基因编辑技术,近年来发展迅速,已成为基因功能活体研究的一种有效方法,广泛应用于许多模式(包括果蝇、家蚕等)及非模式生物中,但在重要农业... 详细信息

CRISPR/Cas9基因编辑系统是由细菌和古细菌抵御外源核酸入侵时的获得性免疫机制发展而来的一项基因编辑技术,近年来发展迅速,已成为基因功能活体研究的一种有效方法,广泛应用于许多模式(包括果蝇、家蚕等)及非模式生物中,但在重要农业害虫中的应用很少。二化螟Chilo suppressalis(Walker)是重要的钻蛀性害虫,严重为害水稻、小麦、甘蔗等作物。长期以来,二化螟防治以化学防治为主,导致害虫抗药性及化学农药残留等问题日趋严重,亟待研究和开发替代性防治技术。性信息素结合蛋白(Pheromone binding protein,PBP)是气味结合蛋白(Odorant binding protein,OBP)的一个亚家族,主要功能被认为是识别并结合疏水性的性信息素分子,携带其穿过亲水性的感器淋巴液到达感受神经树突膜表面的受体,因而在性信息素感受中起重要作用,可望作为靶标开发应用于害虫的行为调控。鳞翅目昆虫通常含有多个PBP基因,不同PBP在功能上是否分化?它们在性信息素感受中的作用大小有无差异?对此,尽管有不少间接的研究推测,但由于技术的限制,很少有活体功能研究的直接证据。本文以二化螟为研究对象,利用CRISPR/Cas9系统分别敲除PBP1和PBP3基因,并筛选获得了 CsupPBP1和CsupPBP3两个突变品系。在此基础上,进一步利用触角电位(Electroantennography,EAG)技术,测定了突变品系雄蛾对性信息素的电生理反应。研究结果证实了 PBP1较PBP3在二化螟性信息素感受中起到更为重要的作用,并认为不同PBP间可能存在着互作及补偿效应,深化了有关性信息素感受机制的认识,同时为利用CRISPR/Cas9技术对蛾类昆虫嗅觉基因进行活体功能研究提供了重要方法参考。主要研究结果如下:1.利用CRISPR/Cas9系统对二化螟PBP1和PBP3基因的敲除根据二化螟PBP1和PBP3基因的cDNA序列获得基因组DNA全长序列,分别在两个基因的第二个外显子上各选择一个靶标位点,然后设计并合成sgRNA和Cas9 mRNA。将sgRNA/Cas9 mRNA共同注射到产后4 h内的新鲜卵中,注射24 h后利用部分卵的基因组DNA检测是否有突变发生。PBP1基因的嵌合突变率为21.3%,而PBP3的嵌合突变率为19.5%;进一步的单克隆测序结果显示,PBP1基因的15个阳性单克隆中有7种不同的基因突变类型,PBP3基因的15个阳性单克隆中有6种不同的突变基因型。2.二化螟PBP1和PBP3突变纯合品系的筛选采取单对系内配对的方法,经过3代筛选获得了缺失17 bp的PBP1基因突变后代和缺失7bp的PBP3基因突变后代,两个基因的突变均导致蛋白翻译提前终止,其中PBP1基因在翻译82个氦基酸后终止,PBP3基因在69个氨基酸后终止。经和野生型完整序列(PBP1的167个氨基酸以及PBP3的166个氨基酸)比较,2个PBP突变品系均导致大片段缺失,特别是分别缺失了 5个保守的半胱氨酸,因此认为2个突变品系完全丧失了PBP1或PBP3的功能。3.二化螟PBP1和PBP3突变品系的触角电位反应测定分别利用PBP1和PBP3第3代的杂合突变个体及纯合突变个体的2日龄雄虫,测定了雄虫触角对二化螟3种性信息素组分(Z11-16:Ald、Z13-18:Ald、Z9-16:Ald)在1 ng、10ng、100ng、1000ng剂量下的触角电位反应。结果表明,两种突变雄蛾对性信息素组分的反应均有显著下降:PBP1纯合突变雄虫对3种性信息素组分在所有剂量下的反应均显著降低,但PBP3纯合突变雄虫对Z11-16:Ald在1ng、100ng、1000ng剂量时的反应显著降低,而对Z13-18:Ald和Z9-16:Ald只在较高剂量(10-1000 ng)下呈现显著差异。结果表明,尽管2个PBP在性信息素感受中均起作用,但比较而言,PBP1的作用更为重要。该结果与2个基因在雄蛾触角中的相对表达量及雌雄表达差异基本一致,但不同PBP间可能存在功能互作效应及补偿机制。对突变杂合个体的测定结果发现,与野生型相比,2种杂合个体对3不同性信息素组分的EAG反应均明显降低,但降低程度较突变纯合个体要小。PBP1杂合突变雄虫对100 ng的Z11-16:Ald以及1000 ng的Z13-18:Ald才表现出反应的显著下降,并且杂合雄虫对Z9-16:Ald的反应均无显著变化;PBP3杂合突变个体对Z11-16:Ald和Z13-18:Ald仅在两个高剂量条件下电生理反应显著降低,但对Z9-16:Ald的4个剂量均无显著变化。因此,就电生理反应的表型而言,2个PBP基因的突变均为不完全显性突变。

关键词： CRISPR/Cas9系统二化螟性信息素结合蛋白触角电位反应性信息素

舞毒蛾性信息素结合蛋白和嗅觉受体OrCo的功能研究

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舞毒蛾性信息素结合蛋白和嗅觉受体OrCo的功能研究

作者：秦浩山东农业大学

学位级别：硕士

舞毒蛾Lymantria dispar (Linnaeus)是全球森林生态系统最具危害性的森林害虫类群之一,具有十分突出的检疫重要性。该害虫大量爆发时,植物叶片常被食光,严重影响林木生长,甚至导致树木死亡。舞毒蛾在寻找寄主、配偶以及取食等过程中,嗅... 详细信息

舞毒蛾Lymantria dispar (Linnaeus)是全球森林生态系统最具危害性的森林害虫类群之一,具有十分突出的检疫重要性。该害虫大量爆发时,植物叶片常被食光,严重影响林木生长,甚至导致树木死亡。舞毒蛾在寻找寄主、配偶以及取食等过程中,嗅觉和味觉在虫体同外界化学信息交流过程中起着重要的作用。因此,对其成虫嗅觉系统的深入研究就是控制其为害的一个突破点。研究气味受体的特性、变异及专一性对于阐明嗅觉识别的分子机理是非常重要的。本研究首先利用RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction)和RACE (rapid-amplification of cDNA ends)技术获得了舞毒蛾非典型受体蛋白OrCo (coreceptor)基因,并对其进行序列分析,验证正确性之后采用RNAi技术成功沉默了舞毒蛾嗅觉受体基因orco和目前已知的性信息素结合蛋白(Pheromone binding protein, PBP)基因pbp1、pbp2。现将主要研究结果总结如下：(1)成功克隆舞毒蛾Lymantria dispar (Linnaeus)的OrCo气味受体基因,并分析了其序列特征,验证了基因序列的正确性,为进一步研究舞毒蛾气味受体的功能,OrCo基因的进化以及揭秘嗅觉机制奠定基础,同时也可以为害虫生物防治提供新的途径和方法。(2)利用RNAi技术沉默了舞毒蛾嗅觉受体基因orco以及性信息素结合蛋白基因pbp1和pbp2,然后采用电生理实验和Real-time PCR实验检测并验证基因沉默效果。结果显示这三个基因表达的缺失严重影响了舞毒蛾对性信息素的识别,初步验证了舞毒蛾orco基因所行使的功能与前人研究的其它昆虫的同类基因非常相似,并且发现这三个基因在功能上体现出相互促进的效果,说明气味分子进入舞毒蛾嗅觉感器进行信号传导的过程与前人研究的其它昆虫的传导过程相似,但就其具体的传导机制仍需做进一步的研究。这为利用RNAi技术防控舞毒蛾提供了重要依据,也为进一步研究舞毒蛾相关基因的功能提供了特异、高效、快速、简便的技术手段。

关键词：舞毒蛾性信息素结合蛋白嗅觉受体基因沉默

长足大竹象性信息素结合蛋白PBP1的克隆、表达及功能研究

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长足大竹象性信息素结合蛋白PBP1的克隆、表达及功能研究

作者：苏婷四川农业大学

学位级别：硕士

昆虫嗅觉系统作为昆虫进行觅食、寻偶、交配等一系列生命活动的化学监测器,能特异的识别环境中的信息化学物质。长足大竹象（Cvrtotrachelusbuqueti）是我国南方重要的钻蛀性林业害虫,危害多种丛生竹类,严重影响竹类产业发展。在昆虫世... 详细信息

昆虫嗅觉系统作为昆虫进行觅食、寻偶、交配等一系列生命活动的化学监测器,能特异的识别环境中的信息化学物质。长足大竹象（Cvrtotrachelusbuqueti）是我国南方重要的钻蛀性林业害虫,危害多种丛生竹类,严重影响竹类产业发展。在昆虫世代繁衍过程中,雌雄个体间如何通过嗅觉系统远距离精确搜索定位成为雌雄个体间是否有效交流的关键。本文根据前期高通量测序筛选序列,利用RT-PCR技术成功克隆得到长足大竹象的一个性信息素结合蛋白基因,利用SYBR Green Ⅰ荧光染料法,采用荧光定量PCR（quantitative PCR,qPCR）分析了CbuqPBP 在雌雄成虫不同组织中的转录表达谱,并进行表达纯化,运用荧光竞争结合技术对该蛋白与主要虫体挥发物和寄主挥发物等的结合特性进行分析,初步探讨了该蛋白的功能。主要研究结果如下:1.根据前期高通量测序结果（GenBanknumber:SAMN06176790）筛选设计引物,运用RT-PCR技术克隆得到长足大竹象性信息素结合蛋白PBP1基因（Genebank登录号为KU845733.1）,编码143个氨基酸,N-末端包含17个氨基酸,预测为信号肽序列。预测蛋白分子量为15.8411 kDa,等电点为4.60,含有6个保守的半胱氨酸位点,具有昆虫PBPs 一级结构的特性。多序列比对和进化树分析结果表明,推定的CbuqPBP1氨基酸序列与鞘翅目和鳞翅目昆虫相似性分别为38.47%、52.39%,与Anomala rufocuprea金龟PBP2、PBP3的相似性较其他种昆虫的PBPs高,且在进化上为同一支系。2.运用qPCR技术,对CbuqPBP1在长足大竹象雌雄成虫不同组织（触角、去触角头、胸、腹末和足）中的分布进行研究。结果表明:CbuqPBP1在长足大竹象雌雄成虫的触角、去触角头和胸部中表达,在腹末和足上不表达,且在触角高丰度表达,在去触角头和胸部极少量表达。对于雌虫和雄虫而言,在有表达的器官中,又都出现雄虫表达量高于雌虫的现象。3.将CbuqPBP1构建到原核表达载体pET-28a（+）中,转入大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导成功表达,SDS-PAGE检测得到一条16 kD左右的蛋白条带。经优化条件（37℃,3h,IPTG1mmol/L）诱导后融合表达,经镍离子亲和层析、过滤、浓缩得到较高纯度,浓度为345 ng/μL的目的蛋白,为进一步荧光竞争结合试验奠定了基础。4.以1-NPN为荧光探针,研究了 CbuqPBP1蛋白与14种长足大竹象体表挥发物、3种慈竹挥发物和3种虫体-寄主混合挥发物的竞争结合能力。结果表明:CbuqPBP1能够与11种虫体挥发物和3种寄主挥发物有效结合。其中,CbuqPBP1与邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯和邻苯二甲酸二丁酯结合能力最强,结合常数分别为6.49 μM、11.10μM;CbuqPBP1与苯甲醛、芳樟醇、吲哚三种寄主植物挥发物结合能力一般,结合常数分别为28.43 μM、29.77 μM、32.90 μM;苯甲醛、芳樟醇、吲哚与邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯按1:1比例混配后结合能力较3种寄主挥发物单独存在时强了62.3%、65.1%、51.7%。初步推测,CbuqPBP1为长足大竹象性信息素结合蛋白,在感受性信息素中发挥重要作用,而且寄主植物气味化合物的加入可能对雄虫觅偶有增效作用。

关键词：长足大竹象性信息素结合蛋白基因克隆基因表达竞争结合

杨小舟蛾嗅觉相关基因鉴定及性信息素结合蛋白的功能研究

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杨小舟蛾嗅觉相关基因鉴定及性信息素结合蛋白的功能研究

作者：宋靖康安徽农业大学

学位级别：硕士

杨小舟蛾（Micromelalopha troglodyta）是鳞翅目（Lepidoptera）舟蛾科（Notodontidae）昆虫,在我国分布广泛,是重大杨树食叶害虫之一,于2019年被国家林业和草原局定为三级危害性林业有害生物。本研究基于转录组测序技术,重点挖掘杨小... 详细信息

杨小舟蛾（Micromelalopha troglodyta）是鳞翅目（Lepidoptera）舟蛾科（Notodontidae）昆虫,在我国分布广泛,是重大杨树食叶害虫之一,于2019年被国家林业和草原局定为三级危害性林业有害生物。本研究基于转录组测序技术,重点挖掘杨小舟蛾潜在的嗅觉相关基因,构建杨小舟蛾嗅觉候选基因系统发育树,探究杨小舟蛾与其他昆虫嗅觉基因的进化关系;研究分析杨小舟蛾候选信息素结合蛋白基因（Mtro PBPs）的表达特性;采用原核表达和荧光竞争结合法研究了PBP蛋白的功能。主要研究结果如下:（1）通过对杨小舟蛾雌雄触角及幼虫头部转录组测序得到的53888条Unigene进行功能注释,成功注释到NR数据库、Swiss-prot数据库、Pfam数据库、Egg NOG数据库、GO数据库、KEGG库的Unigene分别有20965条、13546条、15087条、20100条、15242条、11934条。（2）通过利用Blast对同源序列进行对比之后,在杨小舟蛾转录组数据中鉴定得到37个Mtro OBPs（其中包含3个Mtro PBPs）、23个Mtro CSPs、2个Mtro SNMPs、41个Mtro ORs、5个Mtro GRs、13个Mtro IRs、35个Mtro CXEs。（3）Mtro PBPs组织表达谱显示Mtro PBP1,2,3在雌雄成虫触角中特异性高表达,且雄虫触角表达量显著高于雌虫。（4）Mtro PBP1,2,3与荧光探针1-NPN有较强的结合力(Mtro PBP1 K=8.727μM,Mtro PBP2 K=8.185μM,Mtro PBP3 K=9.395μM),与杨小舟蛾性信息素组分Z13,E15-18:Ald的荧光竞争性结合实验结果表明,Mtro PBP1,2,3蛋白与杨小舟蛾性信息素组分Z13,E15-18:Ald均有较好的结合特性（Mtro PBP1 Ki=0.68μM,Mtro PBP2 Ki=0.54μM,Mtro PBP3 Ki=0.70μM）。以上研究结果为揭示杨小舟蛾性信息素识别机制奠定基础,同时也为利用反向化学生态学手段防控杨小舟蛾提供潜在靶标。

关键词：杨小舟蛾嗅觉基因性信息素结合蛋白荧光竞争结合

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昆虫性信息素结合蛋白功能研究进展

农学学报 2017年第9期7卷 14-20页

作者：田志强孙丽娜李艳艳张怀江闫文涛岳强全林发仇贵生中国农业科学院果树研究所辽宁兴城125100

嗅觉系统在昆虫的生命活动中具有重要的功能作用。通过嗅觉蛋白来识别环境中以及种内所释放的化学信号物质,进而指导昆虫完成求偶,躲避天敌等生命活动。近些年来,随着转录组测序技术的日益发展,许多昆虫的嗅觉家族相关基因已被鉴定。而... 详细信息

嗅觉系统在昆虫的生命活动中具有重要的功能作用。通过嗅觉蛋白来识别环境中以及种内所释放的化学信号物质,进而指导昆虫完成求偶,躲避天敌等生命活动。近些年来,随着转录组测序技术的日益发展,许多昆虫的嗅觉家族相关基因已被鉴定。而性信息素结合蛋白(pheromone binding protein,PBPs)因其功能的特殊性与重要性,一直以来备受研究者的关注。目前,丰富的科学手段,例如电压钳,RNAi,EAG等已为嗅觉蛋白功能做出了不同的阐述,并有一些新的发现,但目前尚存在一些问题亟待解决。笔者根据国内外近些年的研究进展,从昆虫性信息素结合蛋白的理化性质、不同组织表达模式及其与其他嗅觉相关蛋白之间的关系等方面进行了综述。

关键词：性信息素结合蛋白触角昆虫嗅觉基因功能