利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对二化螟性信息素结合蛋白基因功能的研究

作     者：董筱桐 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：董双林

授予年度：2017年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：CRISPR/Cas9系统 二化螟 性信息素结合蛋白 触角电位反应 性信息素 

摘      要：CRISPR/Cas9基因编辑系统是由细菌和古细菌抵御外源核酸入侵时的获得性免疫机制发展而来的一项基因编辑技术,近年来发展迅速,已成为基因功能活体研究的一种有效方法,广泛应用于许多模式(包括果蝇、家蚕等)及非模式生物中,但在重要农业害虫中的应用很少。二化螟Chilo suppressalis(Walker)是重要的钻蛀性害虫,严重为害水稻、小麦、甘蔗等作物。长期以来,二化螟防治以化学防治为主,导致害虫抗药性及化学农药残留等问题日趋严重,亟待研究和开发替代性防治技术。性信息素结合蛋白(Pheromone binding protein,PBP)是气味结合蛋白(Odorant binding protein,OBP)的一个亚家族,主要功能被认为是识别并结合疏水性的性信息素分子,携带其穿过亲水性的感器淋巴液到达感受神经树突膜表面的受体,因而在性信息素感受中起重要作用,可望作为靶标开发应用于害虫的行为调控。鳞翅目昆虫通常含有多个PBP基因,不同PBP在功能上是否分化?它们在性信息素感受中的作用大小有无差异?对此,尽管有不少间接的研究推测,但由于技术的限制,很少有活体功能研究的直接证据。本文以二化螟为研究对象,利用CRISPR/Cas9系统分别敲除PBP1和PBP3基因,并筛选获得了 CsupPBP1和CsupPBP3两个突变品系。在此基础上,进一步利用触角电位(Electroantennography,EAG)技术,测定了突变品系雄蛾对性信息素的电生理反应。研究结果证实了 PBP1较PBP3在二化螟性信息素感受中起到更为重要的作用,并认为不同PBP间可能存在着互作及补偿效应,深化了有关性信息素感受机制的认识,同时为利用CRISPR/Cas9技术对蛾类昆虫嗅觉基因进行活体功能研究提供了重要方法参考。主要研究结果如下:1.利用CRISPR/Cas9系统对二化螟PBP1和PBP3基因的敲除根据二化螟PBP1和PBP3基因的cDNA序列获得基因组DNA全长序列,分别在两个基因的第二个外显子上各选择一个靶标位点,然后设计并合成sgRNA和Cas9 mRNA。将sgRNA/Cas9 mRNA共同注射到产后4 h内的新鲜卵中,注射24 h后利用部分卵的基因组DNA检测是否有突变发生。PBP1基因的嵌合突变率为21.3%,而PBP3的嵌合突变率为19.5%;进一步的单克隆测序结果显示,PBP1基因的15个阳性单克隆中有7种不同的基因突变类型,PBP3基因的15个阳性单克隆中有6种不同的突变基因型。2.二化螟PBP1和PBP3突变纯合品系的筛选采取单对系内配对的方法,经过3代筛选获得了缺失17 bp的PBP1基因突变后代和缺失7bp的PBP3基因突变后代,两个基因的突变均导致蛋白翻译提前终止,其中PBP1基因在翻译82个氦基酸后终止,PBP3基因在69个氨基酸后终止。经和野生型完整序列(PBP1的167个氨基酸以及PBP3的166个氨基酸)比较,2个PBP突变品系均导致大片段缺失,特别是分别缺失了 5个保守的半胱氨酸,因此认为2个突变品系完全丧失了PBP1或PBP3的功能。3.二化螟PBP1和PBP3突变品系的触角电位反应测定分别利用PBP1和PBP3第3代的杂合突变个体及纯合突变个体的2日龄雄虫,测定了雄虫触角对二化螟3种性信息素组分(Z11-16:Ald、Z13-18:Ald、Z9-16:Ald)在1 ng、10ng、100ng、1000ng剂量下的触角电位反应。结果表明,两种突变雄蛾对性信息素组分的反应均有显著下降:PBP1纯合突变雄虫对3种性信息素组分在所有剂量下的反应均显著降低,但PBP3纯合突变雄虫对Z11-16:Ald在1ng、100ng、1000ng剂量时的反应显著降低,而对Z13-18:Ald和Z9-16:Ald只在较高剂量(10-1000 ng)下呈现显著差异。结果表明,尽管2个PBP在性信息素感受中均起作用,但比较而言,PBP1的作用更为重要。该结果与2个基因在雄蛾触角中的相对表达量及雌雄表达差异基本一致,但不同PBP间可能存在功能互作效应及补偿机制。对突变杂合个体的测定结果发现,与野生型相比,2种杂合个体对3不同性信息素组分的EAG反应均明显降低,但降低程度较突变纯合个体要小。PBP1杂合突变雄虫对100 ng的Z11-16:Ald以及1000 ng的Z13-18:Ald才表现出反应的显著下降,并且杂合雄虫对Z9-16:Ald的反应均无显著变化;PBP3杂合突变个体对Z11-16:Ald和Z13-18:Ald仅在两个高剂量条件下电生理反应显著降低,但对Z9-16:Ald的4个剂量均无显著变化。因此,就电生理反应的表型而言,2个PBP基因的突变均为不完全显性突变。