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核桃举肢蛾性信息素结合蛋白2的分子克隆和免疫荧光定位

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昆虫学报 2015年第10期58卷 1054-1062页

作者：李文海黄兴龙王敦冯纪年西北农林科技大学植保资源与病虫害治理教育部重点实验室陕西杨凌712100

【目的】明确核桃举肢蛾Atrijuglans hetaohei Yang性信息素结合蛋白2(Ahet PBP2)在核桃举肢蛾触角中的分布。【方法】本研究提取羽化后3-4 d的核桃举肢蛾成虫触角总RNA并反转录合成c DNA,设计简并引物进行RTPCR获得c DNA片段,然后利用R... 详细信息

【目的】明确核桃举肢蛾Atrijuglans hetaohei Yang性信息素结合蛋白2(Ahet PBP2)在核桃举肢蛾触角中的分布。【方法】本研究提取羽化后3-4 d的核桃举肢蛾成虫触角总RNA并反转录合成c DNA,设计简并引物进行RTPCR获得c DNA片段,然后利用RACE技术获得Ahet PBP2全长c DNA序列。将去除信号肽序列的Ahet PBP2进行原核表达,重组蛋白经镍柱纯化并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。制备的多克隆抗体作为一抗对核桃举肢蛾触角进行免疫组化分析。【结果】Ahet PBP2基因c DNA序列全长923 bp,开放阅读框504 bp,共编码167个氨基酸,分子量为19.26 k D,等电点为5.47。1 mmol/L IPTG诱导10 h获得可溶性重组蛋白,Western blot结果表明重组蛋白诱导表达成功,ELISA检测显示抗体效价为1∶1 024 000。免疫荧光定位结果显示核桃举肢蛾成虫触角部分感器被Ahet PBP2抗体标记。【结论】核桃举肢蛾成虫触角的部分感器中可能存在Ahet PBP2,推测该部分感器具有感受性信息素的功能。

关键词：核桃举肢蛾性信息素结合蛋白原核表达多克隆抗体免疫荧光定位

桃蛀螟性信息素结合蛋白CpunPBP3的表达模式及性信息素结合特性

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昆虫学报 2021年第3期64卷 318-326页

作者：陈秋应杨喜游东蕊杨沐徐志峰肖伟西南大学植物保护学院昆虫学及害虫控制工程重点实验室重庆400715 西南大学农业科学研究院重庆400715

【目的】本研究旨在对桃蛀螟Conogethes punctiferalis性信息素结合蛋白CpunPBP3进行鉴定和定性分析,完善对桃蛀螟性信息素感受机制的理解。【方法】扩增、分析桃蛀螟CpunPBP3的cDNA序列,并与其他草螟科昆虫的同源蛋白氨基酸序列进行比... 详细信息

【目的】本研究旨在对桃蛀螟Conogethes punctiferalis性信息素结合蛋白CpunPBP3进行鉴定和定性分析,完善对桃蛀螟性信息素感受机制的理解。【方法】扩增、分析桃蛀螟CpunPBP3的cDNA序列,并与其他草螟科昆虫的同源蛋白氨基酸序列进行比较。利用qRT-PCR测定桃蛀螟不同日龄雄成虫触角中CpunPBP3的表达量变化,以及该基因表达的昼夜波动;以性信息素反-10-十六碳烯醛(E 10-16∶Ald)(150 ng)和顺-10-十六碳烯醛(Z 10-16∶Ald)(6 ng)对雄成虫进行诱导,并检测诱导后24 h内不同时间节点时触角中CpunPBP3的表达量。构建重组表达载体pET-30a(+)/CpunPBP 3,通过大肠杆菌Escherichia coli表达获得重组蛋白,并通过荧光竞争实验检测纯化重组蛋白CpunPBP3与上述2种性信息素成分的结合能力。【结果】系统发育分析结果显示,CpunPBP 3与已经鉴定的桃蛀螟PBP基因CpunPBP 2和CpunPBP 5分布在不同分支中,但与其他昆虫物种的PBP基因亲缘关系较近;qRT-PCR结果表明,雄成虫触角中CpunPBP3的表达量在羽化后0-8 d呈先升高后下降的趋势,24 h光周期内17∶00时的表达量显著高于1∶00时的,其余时间节点间的表达量无显著差异;150 ng的E 10-16∶Ald诱导3和6 h后的表达量显著下降,6 ng的Z 10-16∶Ald诱导6和24 h后的表达量显著增加。荧光竞争结合实验结果表明,CpunPBP3重组蛋白与性信息素E 10-16∶Ald和Z 10-16∶Ald均有强结合能力,K i值分别为9.267和8.656μmol/L。【结论】本研究明确了CpunPBP3的核苷酸和氨基酸序列及其表达模式,能够响应性信息素的诱导而表达,而且CpunPBP3重组蛋白能够很好地结合性信息素,表明CpunPBP3是桃蛀螟的一条性信息素结合蛋白。

关键词：桃蛀螟性信息素结合蛋白表达模式昼夜节律原核表达荧光竞争结合实验

光肩星天牛性信息素结合蛋白AglaPBP1和AglaPBP2基因鉴定和表达分析

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应用昆虫学报 2017年第1期54卷 45-55页

作者：王菁桢胡平骆有庆陶静北京林业大学林木有害生物防治北京市重点实验室北京100083

[目的]为了鉴定光肩星天牛Anoplophora glabripennis(Motsch.)的性信息素结合蛋白PBPs基因并明确其在雌雄成虫不同部位的表达差异。[方法]本文基于光肩星天牛触角转录组测序数据,通过blast比对得到2条PBPs基因片段,克隆测序得到2条PBPs... 详细信息

[目的]为了鉴定光肩星天牛Anoplophora glabripennis(Motsch.)的性信息素结合蛋白PBPs基因并明确其在雌雄成虫不同部位的表达差异。[方法]本文基于光肩星天牛触角转录组测序数据,通过blast比对得到2条PBPs基因片段,克隆测序得到2条PBPs基因的全序列,并进行生物信息学分析。采用Real-time PCR方法分析了2条PBPs基因在光肩星天牛雌雄成虫间的表达差异。[结果]克隆得到性信息素结合蛋白基因,命名为AglaPBP1(GenBank登录号:KX272639)和AglaPBP2(GenBank登录号:KX272640)。AglaPBP1开放阅读框长为411 bp,编码136个氨基酸,预测分子量为15.02 ku,等电点为4.22,AglaPBP2开放阅读框长为408 bp,编码135个氨基酸,预测分子量为15.00 ku,等电点为5.16。AglaPBP1和AglaPBP2都有完整的信号肽,分别位于1-21位氨基酸和1-19位氨基酸。AglaPBP1和AglaPBP2氨基酸序列中均有6个保守的半胱氨酸残基,与云斑天牛Batocerahorsfieldi(Hope)BhorPBP1和BhorPBP2的同源性分别为74%和49%。qPCR结果显示:AglaPBP1在雌雄虫触角、下颚须,以及雌虫足中均有的表达,且雌虫触角表达量高于雄虫。AglaPBP2仅在雄虫触角中显著表达,在雌雄虫的下颚须中也有少量表达。[结论]克隆获得了AglaPBP1和AglaPBP2基因序列,并明确了这两个基因在成虫不同部位的表达情况,为进一步研究其功能,从而为更好地了解PBPs在光肩星天牛嗅觉识别过程中的作用奠定了基础。

关键词：光肩星天牛性信息素结合蛋白克隆表达谱分析

桃蛀螟性信息素结合蛋白Cpun-PBP1的cDNA克隆、表达谱及其与配体化合物的结合特性分析

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昆虫学报 2015年第11期58卷 1167-1176页

作者：贾小俭郝少东杜艳丽张民照覃晓春王进忠王海香冀卫荣山西农业大学林学院山西太谷030801 北京农学院植物科学技术学院农业应用新技术重点实验室北京102206

【目的】为了更好地了解性信息素结合蛋白(pheromone binding proteins,PBPs)在桃蛀螟Conogethes punctiferalis(Guenée)嗅觉识别过程中的作用,明确其与配体化合物的结合特性。【方法】本研究利用RT-PCR结合RACE方法克隆了桃蛀螟一个... 详细信息

【目的】为了更好地了解性信息素结合蛋白(pheromone binding proteins,PBPs)在桃蛀螟Conogethes punctiferalis(Guenée)嗅觉识别过程中的作用,明确其与配体化合物的结合特性。【方法】本研究利用RT-PCR结合RACE方法克隆了桃蛀螟一个性信息素结合蛋白基因;采用Real-time PCR方法分析了该蛋白在桃蛀螟不同发育阶段及雌雄蛾间的表达差异;利用荧光竞争结合实验对Cpun-PBP1蛋白与16种配基化合物的结合特性进行了分析。【结果】克隆了一个桃蛀螟性信息素结合蛋白基因,命名为Cpun-PBP1(Gen Bank登录号:KP027486)。Cpun-PBP1开放阅读框全长510 bp,编码169个氨基酸,预测分子量为19.12 k Da,等电点为5.09,N-末端包括由起始位置开始的30个氨基酸组成的信号肽。蛋白特征分析显示,该氨基酸序列具有昆虫气味结合蛋白的典型特征,即含有6个保守的半胱氨酸残基。Cpun-PBP1在桃蛀螟成虫阶段表达量最高,且几乎全部在触角中表达,卵期微量表达,幼虫期和蛹期均不表达。通过构建Cpun-PBP1原核表达载体,诱导并获得Cpun-PBP1重组蛋白。荧光竞争结合实验对2种性信息素组分和14种寄主植物挥发物的结合力发现,Cpun-PBP1不但能有效地与桃蛀螟性信息素组分(顺-10-十六碳烯醛和十六醛)结合,结合常数分别为7.32和9.39μmol/L;还能与8种寄主植物挥发物有效结合;其中,与莰烯的结合能力最强,结合常数为3.76μmol/L。【结论】根据这些结果,我们推测Cpun-PBP1在桃蛀螟感受性信息素和寄主植物挥发物的过程中发挥着双重作用。

关键词：桃蛀螟性信息素结合蛋白基因克隆表达谱分析原核表达荧光竞争结合

草地贪夜蛾4个性信息素结合蛋白基因的克隆及表达模式分析

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环境昆虫学报 2020年第3期42卷 583-592页

作者：刘苏蒋兴川蒋秀云陈诚孙劲超沈怿丹李桂亭操海群作物有害生物综合治理安徽省重点实验室植物病虫害生物学与绿色防控安徽普通高校重点实验室安徽农业大学植物保护学院合肥230036 安徽审计职业学院合肥230601

草地贪夜蛾是世界性的重大害虫,2019年1月入侵我国并迅速扩散到20多个省市。性诱剂是对草地贪夜蛾进行监测和诱杀的有效手段,但是其作用识别机制仍不清楚,限制了高效性诱剂的研发和应用。性信息素结合蛋白(PBPs)在鳞翅目昆虫包括草地贪... 详细信息

草地贪夜蛾是世界性的重大害虫,2019年1月入侵我国并迅速扩散到20多个省市。性诱剂是对草地贪夜蛾进行监测和诱杀的有效手段,但是其作用识别机制仍不清楚,限制了高效性诱剂的研发和应用。性信息素结合蛋白(PBPs)在鳞翅目昆虫包括草地贪夜蛾性信息素识别过程中起重要作用。本研究从草地贪夜蛾中克隆了4个编码PBPs的cDNA序列,命名为SfruPBP1-SfruPBP4。4个SfruPBP s均含有完整的开放阅读框,所编码的蛋白具有性信息素结合蛋白的典型特征:N-端有信号肽、具有保守的6个半胱氨酸残基。系统进化分析显示SfruPBPs与斜纹夜蛾和海灰翅夜蛾PBPs的亲缘关系最近,且4个SfruPBPs被聚在不同的进化分支。4个SfruPBP s基因均由3个外显子和2个内含子组成,内含子插入位点高度保守。此外,4个SfruPBP s在草地贪夜蛾基因组上呈串联排列。SfruPBP1、SfruPBP2和SfruPBP3在成虫触角中特异性表达,其中SfruPBP1和SfruPBP2在雄成虫触角中的表达水平显著高于雌虫,而SfruPBP3在雌雄触角中的表达水平无显著差异。SfruPBP4特异性表达于雄成虫腹部。本研究结果为揭示草地贪夜蛾性信息素识别机制奠定了基础。

关键词：草地贪夜蛾性信息素结合蛋白性信息素识别嗅觉通讯

野桑蚕性信息素结合蛋白(PBP)亚家族基因的克隆与进化分析

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蚕业科学 2009年第4期35卷 776-782页

作者：张升祥崔为正王更先孔令斐徐世清山东农业大学林学院山东泰安271018 邯郸学院生物科学系河北邯郸056005 苏州大学基础医学与生物科学学院江苏苏州215123

蛾类的性信息素信号传递是研究昆虫化学通讯的模型,性信息素结合蛋白(pheromone-binding protein,PBP)亚家族是研究热点之一。克隆了野桑蚕PBP亚家族的3个基因,命名为pbp1、pbp2、pbp3(GenBank登录号:GQ246497、GQ468569、GQ468570)。... 详细信息

蛾类的性信息素信号传递是研究昆虫化学通讯的模型,性信息素结合蛋白(pheromone-binding protein,PBP)亚家族是研究热点之一。克隆了野桑蚕PBP亚家族的3个基因,命名为pbp1、pbp2、pbp3(GenBank登录号:GQ246497、GQ468569、GQ468570)。分析野桑蚕和家蚕pbp基因的编码区,发现碱基突变主要以转换为主(14/18),氨基酸变异主要为同义突变(16/18),成熟蛋白质的理化性质变化小,二级结构无变化,推测野桑蚕向家蚕的进化过程中PBP亚家族的基因功能没有变化。对具有PBP亚家族3个已知基因的6个昆虫物种进行氨基酸遗传距离和同源性分析,结果表明野桑蚕和家蚕间PBP1、PBP2、PBP3的遗传距离分别为0、0.02、0,同源性分别高达100%、98.6%和100%,物种间基因的进化速率很慢,进化分析显示PBP亚家族在这几个物种分化前已经产生。

关键词：野桑蚕家蚕性信息素结合蛋白亚家族基因进化

长足大竹象性信息素结合蛋白PBP1的克隆、表达及功能研究

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长足大竹象性信息素结合蛋白PBP1的克隆、表达及功能研究

作者：苏婷四川农业大学

学位级别：硕士

昆虫嗅觉系统作为昆虫进行觅食、寻偶、交配等一系列生命活动的化学监测器,能特异的识别环境中的信息化学物质。长足大竹象（Cvrtotrachelusbuqueti）是我国南方重要的钻蛀性林业害虫,危害多种丛生竹类,严重影响竹类产业发展。在昆虫世... 详细信息

昆虫嗅觉系统作为昆虫进行觅食、寻偶、交配等一系列生命活动的化学监测器,能特异的识别环境中的信息化学物质。长足大竹象（Cvrtotrachelusbuqueti）是我国南方重要的钻蛀性林业害虫,危害多种丛生竹类,严重影响竹类产业发展。在昆虫世代繁衍过程中,雌雄个体间如何通过嗅觉系统远距离精确搜索定位成为雌雄个体间是否有效交流的关键。本文根据前期高通量测序筛选序列,利用RT-PCR技术成功克隆得到长足大竹象的一个性信息素结合蛋白基因,利用SYBR Green Ⅰ荧光染料法,采用荧光定量PCR（quantitative PCR,qPCR）分析了CbuqPBP 在雌雄成虫不同组织中的转录表达谱,并进行表达纯化,运用荧光竞争结合技术对该蛋白与主要虫体挥发物和寄主挥发物等的结合特性进行分析,初步探讨了该蛋白的功能。主要研究结果如下:1.根据前期高通量测序结果（GenBanknumber:SAMN06176790）筛选设计引物,运用RT-PCR技术克隆得到长足大竹象性信息素结合蛋白PBP1基因（Genebank登录号为KU845733.1）,编码143个氨基酸,N-末端包含17个氨基酸,预测为信号肽序列。预测蛋白分子量为15.8411 kDa,等电点为4.60,含有6个保守的半胱氨酸位点,具有昆虫PBPs 一级结构的特性。多序列比对和进化树分析结果表明,推定的CbuqPBP1氨基酸序列与鞘翅目和鳞翅目昆虫相似性分别为38.47%、52.39%,与Anomala rufocuprea金龟PBP2、PBP3的相似性较其他种昆虫的PBPs高,且在进化上为同一支系。2.运用qPCR技术,对CbuqPBP1在长足大竹象雌雄成虫不同组织（触角、去触角头、胸、腹末和足）中的分布进行研究。结果表明:CbuqPBP1在长足大竹象雌雄成虫的触角、去触角头和胸部中表达,在腹末和足上不表达,且在触角高丰度表达,在去触角头和胸部极少量表达。对于雌虫和雄虫而言,在有表达的器官中,又都出现雄虫表达量高于雌虫的现象。3.将CbuqPBP1构建到原核表达载体pET-28a（+）中,转入大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导成功表达,SDS-PAGE检测得到一条16 kD左右的蛋白条带。经优化条件（37℃,3h,IPTG1mmol/L）诱导后融合表达,经镍离子亲和层析、过滤、浓缩得到较高纯度,浓度为345 ng/μL的目的蛋白,为进一步荧光竞争结合试验奠定了基础。4.以1-NPN为荧光探针,研究了 CbuqPBP1蛋白与14种长足大竹象体表挥发物、3种慈竹挥发物和3种虫体-寄主混合挥发物的竞争结合能力。结果表明:CbuqPBP1能够与11种虫体挥发物和3种寄主挥发物有效结合。其中,CbuqPBP1与邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯和邻苯二甲酸二丁酯结合能力最强,结合常数分别为6.49 μM、11.10μM;CbuqPBP1与苯甲醛、芳樟醇、吲哚三种寄主植物挥发物结合能力一般,结合常数分别为28.43 μM、29.77 μM、32.90 μM;苯甲醛、芳樟醇、吲哚与邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯按1:1比例混配后结合能力较3种寄主挥发物单独存在时强了62.3%、65.1%、51.7%。初步推测,CbuqPBP1为长足大竹象性信息素结合蛋白,在感受性信息素中发挥重要作用,而且寄主植物气味化合物的加入可能对雄虫觅偶有增效作用。

关键词：长足大竹象性信息素结合蛋白基因克隆基因表达竞争结合

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亚洲玉米螟性信息素结合蛋白的功能研究

亚洲玉米螟性信息素结合蛋白的功能研究

作者：孙雅琪沈阳农业大学

学位级别：硕士

亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis (Guenee)是我国玉米的主要害虫,严重影响玉米的产量和质量。亚洲玉米螟为钻蛀性害虫,给防治工作带来很大困难。昆虫利用嗅觉机制调节行为活动,因而,研究寄主识别机理是调控亚洲玉米螟的重要途径。目前,... 详细信息

亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis (Guenee)是我国玉米的主要害虫,严重影响玉米的产量和质量。亚洲玉米螟为钻蛀性害虫,给防治工作带来很大困难。昆虫利用嗅觉机制调节行为活动,因而,研究寄主识别机理是调控亚洲玉米螟的重要途径。目前,信息素防治以其绿色安全,高灵敏度等特点,逐渐成为研究热点,但对亚洲玉米螟嗅觉机制的研究尚不完全。为了更深入地了解亚洲玉米螟的嗅觉机制,主要是性信息素结合蛋白pheromone binding proteins (PBPs)在交配、寻找寄主及种间识别过程中所发挥的重要作用,并利用性信息素和植物挥发物对亚洲玉米螟进行监测和防治,本研究以亚洲玉米螟PBP1-PBP5为研究对象,从蛋白质功能及其应用角度开展研究,在PBPs结合能力、功能位点、免疫定位及电生理几个方面对其做了深入系统的研究。为亚洲玉米螟的预测预报、防治等提供理论基础和新的思路。本研究主要取得如下结果：1.利用RT-PCR技术克隆得到亚洲玉米螟5个PBPs基因序列,经表达纯化得到重组蛋白OfurPBP1-5,利用荧光竞争结合试验检测亚洲玉米螟PBPs与性信息素及其拮抗剂的结合能力,结果显示,OfurPBP3与亚洲玉米螟性信息素(Z/E)12-14:OAc结合能力最强,PBP4-5与欧洲玉米螟Ostrinia nubilalis (Hubner)性信息素(Z/E)11-14:OAc结合能力最强,OfurPBP1-5与性信息素相似物E11-14：OH及拮抗剂Z9-14:OAc都不结合,推测PBP3可能参与亚洲玉米螟性信息素的识别,而PBP4-5参与欧洲玉米螟性信息素的识别。2.利用SWISS-MODEL成功预测了OfurPBP3的三维结构模型,利用CDOCKER软件将亚洲玉米螟性信息素(Z/E)12-14:OAc与OfurPBP3进行对接,预测出Phe12,Ile113, Ile52和Leu94为关键氨基酸位点,并利用定点突变技术结合荧光竞争结合试验对互作关键位点进行验证。3.利用免疫荧光定位技术,观察了重组蛋白OfurPBP1-5在雄蛾各类型触感器中的分布。免疫定位结果显示OfurPBP1和OfurPBP2被标记于毛形感器中,OfurPBP3和OfurPBP5被标记于锥形感器中,OfurPBP4被标记于栓锥感器中,且OfurPBP1-5均在触感器淋巴液中被标记,树突无标记。4.采用触角电位反应技术测试了亚洲玉米螟雌、雄蛾触角对玉米挥发物及性信息素化合物在不同浓度梯度下的反应趋势,确定1 μg/μL为最佳反应浓度,并在该浓度下比较了19种玉米挥发物的EAG反应,同时观察了触角对不同配比Z12-14:OAc/E12-14:OAc在不同浓度梯度下的反应趋势。结果显示：亚洲玉米螟雄蛾触角对1-辛烯-3-醇反应强烈,而雌蛾触角对壬醛反应最强烈。雄蛾触角对亚洲玉米螟性信息素E12-14:OAc和Z12-14:OAc反应极强,而雌蛾触角对拮抗剂Z9-14:OAc反应比对性信息素反应强。在不同浓度配比试验中,浓度在0.01μg/μL～1μg/μL时,雄蛾和雌蛾触角对性信息素和玉米挥发物的EAG反应值均随浓度的升高而变大;随着性信息素配比中E12-14:OAc比例的增加,EAG反应值下降。

关键词：亚洲玉米螟性信息素结合蛋白荧光竞争结合试验免疫定位触角电位反应

长足大竹象性信息素结合蛋白PBP2的克隆、表达及RNAi研究

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长足大竹象性信息素结合蛋白PBP2的克隆、表达及RNAi研究

作者：陶园媛四川农业大学

学位级别：硕士

长足大竹象Cyrtotrachelus buqueti是我国竹林的主要钻蛀性害虫,其危害严重制约了竹产业的发展,但同时该虫又是一种资源昆虫。由于现阶段长足大竹象的防治策略不能兼具虫害防治与资源开发,因此以性信息素结合蛋白基因为靶标,对昆虫觅偶... 详细信息

长足大竹象Cyrtotrachelus buqueti是我国竹林的主要钻蛀性害虫,其危害严重制约了竹产业的发展,但同时该虫又是一种资源昆虫。由于现阶段长足大竹象的防治策略不能兼具虫害防治与资源开发,因此以性信息素结合蛋白基因为靶标,对昆虫觅偶行为进行调控是害虫绿色防控的一条潜在有效途径。本研究利用前期长足大竹象转录组数据克隆得到一个新的性信息素结合蛋白基因Cbuq PBP2,利用实时荧光定量（RT-q PCR）技术分析了该基因的转录时空表达谱;完成了Cbuq PBP2的原核表达与纯化,并利用荧光竞争结合测定了该蛋白与主要的虫体挥发物和寄主植物挥发物的结合能力;在此基础上通过体腔注射法对长足大竹象进行了RNA干扰（RNAi）研究,并结合触角电位对Cbuq PBP2的功能进行了探索,旨在为明确长足大竹象性信息素感受机制,为长足大竹象绿色防控的分子靶标提供理论依据。主要研究结果如下:1、结合转录组数据分析并利用RT-PCR技术克隆出长足大竹象性信息素结合蛋白基因Cbuq PBP2（Gen Bank登录号为MN400445.1）,其编码133个氨基酸。预测该蛋白是一个含有由20个氨基酸组成的信号肽与6个保守半胱氨酸位点的酸性小分子蛋白,属于Classical OBPs亚家族,具有昆虫PBPs一级结构典型特征。同源比对及进化树结果表明,Cbuq PBP2与鞘翅目昆虫PBPs具有较高同源性,与光肩星天牛Anoplophora glabripennis Agla PBP1的氨基酸序列一致性最高为60.87%,且在进化树上关系最近。2、不同组织中,Cbuq PBP2在雌雄成虫触角中高丰度表达,在头部、胸部、腹部中极微弱表达,足中几乎不表达。同时,雄虫在不同组织中的表达量均高于雌虫。不同发育阶段中,Cbuq PBP2在成虫期高丰度表达,卵期和低龄幼虫期几乎不表达,老熟幼虫期和蛹期微弱表达。暗示Cbuq PBP2可能在雄虫求偶过程中起着关键作用。3、利用原核表达系统在优化条件下成功表达了Cbuq PBP2重组蛋白,SDS-PAGE检测显示其主要在上清中表达。对其进行镍柱纯化后获得大小约为15 k Da、浓度为0.4 mg/m L的Cbuq PBP2蛋白,可为进一步研究Cbuq PBP2与气味分子的结合特性奠定基础。4、以1-NPN（N-苯基-1-萘胺）为探针,利用荧光竞争结合实验测定了Cbuq PBP2与12种长足大竹象虫体挥发物、3种慈竹挥发物的结合能力。结果表明:Cbuq PBP2能够与3种虫体挥发物和1种慈竹挥发物有效结合。其中,Cbuq PBP2与邻苯二甲酸二丁酯结合能力最强,解离常数为6.32μmol/L;Cbuq PBP2与芳樟醇和苯乙烯结合能力较强,解离常数分别为10.55μmol/L、11.37μmol/L,其中芳樟醇为慈竹挥发物。Cbuq PBP2与己酸乙酯具有较弱的结合能力,解离常数为39.20μmol/L。5、为进一步验证该蛋白的功能,使用双链RNA（ds RNA）注射法对其成功进行了干扰。1μg/μL、3μg/μL和5μg/μL的ds RNA均不同程度的抑制长足大竹象雄成虫Cbuq PBP2的表达,浓度越高干扰效果越强,但引起的死亡率也越高。96 h后三个浓度注射组Cbuq PBP2的表达抑制效果达到最佳,与未注射组相比分别下降了76.5%、70.0%、90.2%。对注射3μg/μL ds RNA的雄成虫于72 h后进行触角电位（EAG）检测显示,长足大竹象对4种气味化合物（邻苯二甲酸二丁酯、芳樟醇、苯乙烯、己酸乙酯）的EAG反应均有所下降。其中,雄虫触角对邻苯二甲酸二丁酯和苯乙烯的EAG反应分别显著下降35.0%、33.5%。上述结果表明,Cbuq PBP2在长足大竹象信息素识别过程中可能起到了非常重要的作用。

关键词：长足大竹象性信息素结合蛋白表达谱荧光竞争结合 RNA干扰