长足大竹象性信息素结合蛋白PBP2的克隆、表达及RNAi研究

作     者：陶园媛 

作者单位：四川农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨桦

授予年度：2020年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 

主      题：长足大竹象 性信息素结合蛋白 表达谱 荧光竞争结合 RNA干扰 

摘      要：长足大竹象Cyrtotrachelus buqueti是我国竹林的主要钻蛀性害虫,其危害严重制约了竹产业的发展,但同时该虫又是一种资源昆虫。由于现阶段长足大竹象的防治策略不能兼具虫害防治与资源开发,因此以性信息素结合蛋白基因为靶标,对昆虫觅偶行为进行调控是害虫绿色防控的一条潜在有效途径。本研究利用前期长足大竹象转录组数据克隆得到一个新的性信息素结合蛋白基因Cbuq PBP2,利用实时荧光定量（RT-q PCR）技术分析了该基因的转录时空表达谱;完成了Cbuq PBP2的原核表达与纯化,并利用荧光竞争结合测定了该蛋白与主要的虫体挥发物和寄主植物挥发物的结合能力;在此基础上通过体腔注射法对长足大竹象进行了RNA干扰（RNAi）研究,并结合触角电位对Cbuq PBP2的功能进行了探索,旨在为明确长足大竹象性信息素感受机制,为长足大竹象绿色防控的分子靶标提供理论依据。主要研究结果如下:1、结合转录组数据分析并利用RT-PCR技术克隆出长足大竹象性信息素结合蛋白基因Cbuq PBP2（Gen Bank登录号为MN400445.1）,其编码133个氨基酸。预测该蛋白是一个含有由20个氨基酸组成的信号肽与6个保守半胱氨酸位点的酸性小分子蛋白,属于Classical OBPs亚家族,具有昆虫PBPs一级结构典型特征。同源比对及进化树结果表明,Cbuq PBP2与鞘翅目昆虫PBPs具有较高同源性,与光肩星天牛Anoplophora glabripennis Agla PBP1的氨基酸序列一致性最高为60.87%,且在进化树上关系最近。2、不同组织中,Cbuq PBP2在雌雄成虫触角中高丰度表达,在头部、胸部、腹部中极微弱表达,足中几乎不表达。同时,雄虫在不同组织中的表达量均高于雌虫。不同发育阶段中,Cbuq PBP2在成虫期高丰度表达,卵期和低龄幼虫期几乎不表达,老熟幼虫期和蛹期微弱表达。暗示Cbuq PBP2可能在雄虫求偶过程中起着关键作用。3、利用原核表达系统在优化条件下成功表达了Cbuq PBP2重组蛋白,SDS-PAGE检测显示其主要在上清中表达。对其进行镍柱纯化后获得大小约为15 k Da、浓度为0.4 mg/m L的Cbuq PBP2蛋白,可为进一步研究Cbuq PBP2与气味分子的结合特性奠定基础。4、以1-NPN（N-苯基-1-萘胺）为探针,利用荧光竞争结合实验测定了Cbuq PBP2与12种长足大竹象虫体挥发物、3种慈竹挥发物的结合能力。结果表明:Cbuq PBP2能够与3种虫体挥发物和1种慈竹挥发物有效结合。其中,Cbuq PBP2与邻苯二甲酸二丁酯结合能力最强,解离常数为6.32μmol/L;Cbuq PBP2与芳樟醇和苯乙烯结合能力较强,解离常数分别为10.55μmol/L、11.37μmol/L,其中芳樟醇为慈竹挥发物。Cbuq PBP2与己酸乙酯具有较弱的结合能力,解离常数为39.20μmol/L。5、为进一步验证该蛋白的功能,使用双链RNA（ds RNA）注射法对其成功进行了干扰。1μg/μL、3μg/μL和5μg/μL的ds RNA均不同程度的抑制长足大竹象雄成虫Cbuq PBP2的表达,浓度越高干扰效果越强,但引起的死亡率也越高。96 h后三个浓度注射组Cbuq PBP2的表达抑制效果达到最佳,与未注射组相比分别下降了76.5%、70.0%、90.2%。对注射3μg/μL ds RNA的雄成虫于72 h后进行触角电位（EAG）检测显示,长足大竹象对4种气味化合物（邻苯二甲酸二丁酯、芳樟醇、苯乙烯、己酸乙酯）的EAG反应均有所下降。其中,雄虫触角对邻苯二甲酸二丁酯和苯乙烯的EAG反应分别显著下降35.0%、33.5%。上述结果表明,Cbuq PBP2在长足大竹象信息素识别过程中可能起到了非常重要的作用。