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血府逐瘀胶囊干预SIRT1与心脏干细胞改善心肌梗死预后功能的机制研究

血府逐瘀胶囊干预SIRT1与心脏干细胞改善心肌梗死预后功能的机制...

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作者：陈孟倩中国中医科学院

学位级别：硕士

研究背景:影响心肌梗死（MI）预后的主要病理因素是受损心肌功能丧失,如何促进心肌细胞再生是影响预后的关键。已知SIRT1（Silent mating type information regulation 2 homolog-1）能在应激条件下减少细胞凋亡,而心脏干细胞有研究证... 详细信息

研究背景:影响心肌梗死（MI）预后的主要病理因素是受损心肌功能丧失,如何促进心肌细胞再生是影响预后的关键。已知SIRT1（Silent mating type information regulation 2 homolog-1）能在应激条件下减少细胞凋亡,而心脏干细胞有研究证实也可分化为良好的心肌。中药在MI治疗中有着重要地位,课题组通过前期国家自然基金资助项目发现祛瘀生新法能调控SIRT1抑制细胞凋亡,促进干细胞修复受损心肌,但SIRT1与心脏干细胞在MI中的相关性尚无报道。目的:1.通过血府逐瘀胶囊对大鼠心肌梗死模型的干预治疗,观察其疗效并揭示该疗效与SIRT1表达、C-kit+/Lin-干细胞功能调节三者之间的内在联系。2.阐述“心肌梗死能诱使心脏干细胞增殖,SIRT1表达增多可提高心脏干细胞再生能力,祛瘀生新法则具有靶向SIRT1-心脏干细胞效应,从而实现共同修复缺血坏死心肌的作用”假说的科学内涵。3.揭示基于祛瘀生新视角的血府逐疲胶囊疗效机制,为防治心肌梗死提供新思路,结合转化医学促进中医药应用于再生医学。方法:1.心肌梗死模型构建:采用结扎冠状动脉左前降支方法制备心肌梗死模型。选用的大鼠为SPF级健康雄性WISTAR大鼠,200只,体重230±10g。2.实验分组及给药方式:共造模200只,成活104只,手术成活率为52%。按随机数字表法将造模成功大鼠分为以下八组:模型7天组,血府逐瘀胶囊低剂量7天组,血府逐瘀胶囊中剂量7天组,血府逐瘀胶囊高剂量7天组,模型28天组,血府逐瘀胶囊低剂量28天组,血府逐瘀胶囊中剂量28天组,血府逐瘀胶囊高剂量28天组,加上假手术7天组、假手术28天组,共十组。造模后于第12h后行心电图检查,根据心电图ST段抬高和I、AVL、V1-V6导联出现6-8个病理性Q波数量筛选模型,判断心梗的严重程度,剔除梗死程度太重或太轻的大鼠,最终纳入观察动物总数为64只。采用灌胃的方式给药。假手术组:每日以与药物组等容量无菌蒸馏水灌胃,模型组:每日以与药物组等容量无菌蒸馏水灌胃,血府逐瘀胶囊低剂量组:0.216g/kg/次、2ml/次、2次/d,血府逐瘀胶囊中剂量组:0.432g/kg/次、2ml/次、2次/,血府逐疲胶囊高剂量组:0.864g/kg/次、2ml/次、2 次/d。3.心电图检测:分别于造模手术前,术后12h对大鼠进行心电图检测。4.超声检测:采用Vevo 770高分辨率超声影像系统分别于给药7天和28天后对7天组和28天组实验动物进行超声检查。检测指标为左心室后壁舒张末厚度（LVPWd）、左室前壁舒张末厚度（LVAWd）、左室舒张末内径（LVIDd）、左室收缩末内径（LVIDs）,并计算左室短轴率（FS）、左室射血分数（EF）。5.荧光法测心肌梗死面积:采用Fx Pro型号的小动物活体成像对等厚的5片心肌组织进行荧光照射,检测心肌梗死面积。6.TUNEL法检测心肌细胞凋亡。7.实时荧光定量PCR法检测SIRT1、Fox01、C-kit mRNA表达。8.蛋白质免疫印迹（Western-blotting）法检测SIRT1、Bcl-xL等蛋白的表达。9.免疫组化法检测SIRT1、Bcl-xL等蛋白的表达。10.活性氧簇测定心肌梗死后R0S释放。结果:1.心脏超声结果显示,心肌梗死后7天,与假手术组相比,模型组左室舒张末内径（LVIDd）、左室收缩末内径（LVIDs）显著增加,差异有显著统计学意义（P＜0.01）,与模型组相比,血府逐瘀胶囊低剂量组、血府逐瘀胶囊中剂量组LVIDd、LVIDs有减小趋势,且血府逐瘀胶囊低剂量组LVIDd减小差异具有统计学意义（P＜0.05）,血府逐瘀胶囊中剂量组LVIDs减小差异具有显著统计学意义（P＜0.01）;心肌梗死后28天,模型组LVIDd、LVIDs比假手术组显著增加（P＜0.01）,与模型组相比,给药组LVIDd、LVIDs减小差异具有显著统计学意义（P＜0.01）,且与血府逐瘀胶囊中剂量组相比,血府逐瘀胶囊低剂量组LVIDs减少有显著统计学意义（P＜0.01）。2.心脏超声结果显示,心肌梗死后7天,与假手术组相比,模型组左室射血分数（EF）、左室短轴率（FS）显著降低,差异有统计学意义（P＜0.01）,与模型组相比,血府逐瘀胶囊低剂量组EF升高差异具有统计学意义（P＜0.05）,血府逐瘀胶囊低剂量组、血府逐瘀胶囊中剂量组FS升高差异具有显著统计学意义（P＜0.01）,且与血府逐瘀胶囊中剂量组相比,血府逐瘀胶囊低剂量组EF升高差异有统计学意义（P＜0.05）,FS升高差异有显著统计学意义（P＜0.01）;心肌梗死后28天,模型组EF、FS比假手术组显著降低（P＜0.01,P＜0.05）,与模型组相比,给药组EF、FS有增加趋势,且血府逐瘀胶囊低剂量组、血府逐瘀胶囊中剂量组EF、FS比模型组显著增加（P＜0.01）,与血府逐瘀胶囊中剂量组相比,

关键词：血府逐瘀胶囊心肌梗死 SIRT1 心脏干细胞

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HCN4+窦房结细胞接触诱导CD117+心脏干细胞的实验研究

HCN4+窦房结细胞接触诱导CD117+心脏干细胞的实验研究

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作者：薛成川北医学院

学位级别：硕士

目的:探讨HCN4+窦房结细胞接触诱导CD117+心脏干细胞后增强后者向窦房结样细胞分化的可能性,初步分析分化机制,为生物起搏重建治疗缓慢型心律失常等疾病提供理论基础。方法:(1)采用消化法消化窦房结组织,制成细胞悬液,以HCN4为标记,采... 详细信息

目的:探讨HCN4+窦房结细胞接触诱导CD117+心脏干细胞后增强后者向窦房结样细胞分化的可能性,初步分析分化机制,为生物起搏重建治疗缓慢型心律失常等疾病提供理论基础。方法:(1)采用消化法消化窦房结组织,制成细胞悬液,以HCN4为标记,采用磁珠分选法分选HCN4+窦房结细胞;(2)使用消化法消化心脏组织,获得细胞悬液,使用磁珠分选仪分选CD117+心脏干细胞;(3)使用transwell培养皿接触共培养HCN4+窦房结细胞及CD117+心脏干细胞,取诱导10天、20天及30天后的心脏干细胞,采用免疫荧光技术观察心脏干细胞分化情况;采用RT-PCR技术检测HCN2及HCN4的m RNA表达情况。结果:(1)以HCN4为标记,使用磁珠分选仪成功分选HCN4+窦房结细胞,提高了窦房结细胞的纯度;(2)诱导10天后,心脏干细胞表达HCN2及HCN4的阳性率分别是5.2±3.4%、5.8±3.7%,诱导20天后上述蛋白阳性率为7.5±3.6%、7.1±3.5%,诱导30天后上述蛋白阳性率为10.2±3.8%、11.9±4.4%,其中诱导30天组与诱导10天组的标记物阳性率差异有显著统计学意义,P细胞中HCN2及HCN4的m RNA进行检测,结果显示:诱导10天、20天及30天后均有HCN2及HCN4的m RNA表达,且随时间增加表达量明显增加,差异有统计学意义,P细胞。(2)心脏干细胞可以分化为内皮样、心肌样和平滑肌样细胞,同时也具有分化为窦房结样细胞的潜力。(3)通过窦房结细胞接触诱导心脏干细胞,可以提高心脏干细胞分化为窦房结样细胞的效率。

关键词： HCN4 CD117 窦房结细胞心脏干细胞分化

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C-Kit+心脏干细胞在心肌修复中的作用

C-Kit+心脏干细胞在心肌修复中的作用

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作者：龚剑萍重庆医科大学

学位级别：硕士

终末期冠状动脉粥样硬化性心脏病是因大量心肌细胞丧失功能而导致不可逆转性损害,以心力衰竭为主要表现的临床综合征。自发现C-Kit心脏干细胞可诱导分化为心肌细胞后,移植C-Kit心脏干细胞以促进心肌细胞的修复便成为针对心脏疾病治疗的... 详细信息

终末期冠状动脉粥样硬化性心脏病是因大量心肌细胞丧失功能而导致不可逆转性损害,以心力衰竭为主要表现的临床综合征。自发现C-Kit心脏干细胞可诱导分化为心肌细胞后,移植C-Kit心脏干细胞以促进心肌细胞的修复便成为针对心脏疾病治疗的基础及临床研究的热点之一。尽管仍有诸多问题尚待解决,但这为终末期心肌修复的研究带来了新的希望。本文就C-Kit受体及其配体、C-Kit心脏干细胞及其在心肌修复中的作用、局限性作一综述。

关键词： C-Kit受体心脏干细胞心肌修复

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缺氧预处理对心脏干细胞在缺血环境中生存的作用及机制研究

缺氧预处理对心脏干细胞在缺血环境中生存的作用及机制研究

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作者：刘丹遵义医学院

学位级别：硕士

目的:动脉粥样硬化所致的心肌梗死、脑血管疾病和周围血管疾病等,在近年来世界范围内已成为中老年人死亡的主要原因之一。干细胞治疗则是针对这些缺血性疾病所出现的一种新的治疗策略,其中CSCs是目前研究的热点,其自我更新、克隆增殖和... 详细信息

目的:动脉粥样硬化所致的心肌梗死、脑血管疾病和周围血管疾病等,在近年来世界范围内已成为中老年人死亡的主要原因之一。干细胞治疗则是针对这些缺血性疾病所出现的一种新的治疗策略,其中CSCs是目前研究的热点,其自我更新、克隆增殖和多向分化的能力,在心脏损伤修复和维持心脏结构和功能完整性方面具有重要作用,而c-kit+CSCs是心肌组织内最特异性的干细胞。但是在移植区域恶劣的微环境大大降低了干细胞的作用。细胞预处理是改善这一现象的重要手段,其中缺氧预处理则是保护细胞的临床可行的方法。多项研究均显示缺氧预处理对多种细胞的保护作用。缺氧条件下,Nrf2及其激活的下游基因HO-1在细胞生存和抵抗不良环境的防御方面具有关键的作用。研究显示HIF-1α及下游靶基因VEGF对细胞有促生存作用,特别是VEGF以旁分泌方式改善内皮细胞生存和血管生成,且Nrf2活性与HIF-1α的表达水平呈正相关。但目前尚未有缺氧预处理(HPC)对CSCs中Nrf2/ARE通路的作用及相关机制的报道。因此,本研究拟通过缺氧预处理心脏干细胞后检测其在不同状态下的细胞存活情况,并检测Nrf2、HIF-1α及VEGF等指标的表达情况,以初步探讨其作用及相关机制。方法:1.按照本课题组前期已成熟的CSCs培养方法培养SD大鼠的CSCs,通过免疫磁珠法筛选c-kit+CSCs,行流式细胞术鉴定其纯度,并进行随后的实验;2.以不同缺血时间(0,12,24h)处理CSCs,收集细胞后行流式细胞术检测CSCs的细胞周期,确定模拟缺血微环境的最佳时间;3.以不同缺氧时间(0,6,12,24,30h)处理CSCs,通过CCK8法检测不同处理组CSCs的细胞活力,通过流式细胞术检测各组CSCs的凋亡率、存活率及坏死率,确定缺氧预处理CSCs的最佳时间;4.对照组不予任何处理,缺氧组只缺氧处理6h;缺血组只缺血处理24h;缺氧+缺血组在缺氧处理6h后再进行缺血处理,然后收集各组细胞行流式细胞术检测各组CSCs的凋亡;5.对照组不予任何处理,缺氧组只缺氧处理6h;缺血组只缺血处理24h;缺氧+缺血组在缺氧处理6h后再进行缺血处理,免疫荧光检测Nrf2在不同处理中的表达情况;Western blot检测Nrf2、HO-1、HIF-1α及VEGF在各组中的蛋白表达情况;6.对照组不予任何处理,Nrf2(+)组用tBHQ处理12h,缺氧组只缺氧处理6h,Western blot检测HIF-1α及VEGF在各组中的蛋白表达情况。结果:1.体外分离培养的原代CSCs在第3天时呈圆形亮点状贴于培养瓶底部;培养至第7天时贴壁良好,细胞呈梭形、三角形、多角形;在第12天时细胞生长均匀,大约可达到80%-90%的融合。磁珠分选后的CSCs在倒置显微镜下可见细胞呈圆点状散布于培养基中,表面结合有单个或多个磁珠,在3天左右可看到有少量细胞贴壁,细胞表面仍有单个或多个磁珠结合,在7天左右细胞迅速增殖,而且磁珠在镜下几乎观察不到,在10天左右细胞几乎铺满培养瓶。流式细胞术检测CSCs表面标记显示:c-kit+89.8%,CD34 1.9%,CD45 1.7%;2.流式细胞术显示这三组细胞(缺血0,12,24h)大部分处于G0-G1期,而S期的比例随着缺血时间的延长而显著降低。因此,选定缺血24h来模拟缺血微环境;3.CCK8法检测不同的缺氧时间(0,6,12,24,30h)预处理CSCs的细胞活力,与对照组相比,缺氧6h的细胞活力明显增加,但随着时间增长,细胞活力无明显增加,并且在缺氧30h时细胞活力明显降低;以流式细胞术检测各个处理时间的细胞凋亡情况。缺氧6h后细胞凋亡率增加,为4.5%,与对照组相比,有统计学意义(P0.05);但是当缺氧30h时,与对照组相比,存活率明显降低,而凋亡率显著升高,其差异有统计学意义(P细胞术检测不同处理后各组的细胞凋亡情况,缺氧组与对照组相比差异有统计学意义(P细胞凋亡率与缺血组相比,其凋亡率显著降低(P细胞凋亡;5.免疫荧光显示Nrf2在缺氧条件下表达增多;Western blot检测显示与对照组相比,Nrf2、HO-1、HIF-1α及VEGF的表达在缺氧条件下增加(P细胞保护作用所致的;同时,HPC会上调HIF-1α及VEGF的表达,从而

关键词：心肌梗死氧化应激心脏干细胞缺氧预处理 Nrf2/ARE

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小鼠心脏干细胞功能的年龄相关性变化及其调节机制

小鼠心脏干细胞功能的年龄相关性变化及其调节机制

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作者：詹金熹广西师范大学

学位级别：硕士

目的:心脏干细胞在维持心脏组织自稳态和心脏损伤后的修复中起关键性作用,其由衰老引起的功能退行性变化可能是年龄相关心脏病的主要因素之一。本研究利用实验动物C57BL/6J小鼠,旨在分离鉴定具有分化和自我更新能力的心脏干细胞群和探... 详细信息

目的:心脏干细胞在维持心脏组织自稳态和心脏损伤后的修复中起关键性作用,其由衰老引起的功能退行性变化可能是年龄相关心脏病的主要因素之一。本研究利用实验动物C57BL/6J小鼠,旨在分离鉴定具有分化和自我更新能力的心脏干细胞群和探明其功能的年龄相关性变化的特征。本研究的另一个目的是,通过重点分析转录辅助因子Cited 2的可能作用以及青年和老年组心脏干细胞基因表达谱的比较,初步阐明心脏干细胞衰老的分子调控机制。方法:(1)小鼠心脏干细胞分离:断颈法处死C57BL/6J小鼠后,取心脏组织并通过机械剪碎和胶原酶Ⅱ消化处理及细胞筛过滤获得单细胞悬液。(2)小鼠心脏干细胞流式分析及分选:新鲜分离的细胞经4种抗表面标志蛋白荧光抗体孵育后,进行流式表型、细胞周期分析和分选。(3)心脏干细胞分化和增殖能力检测:分选得到的心脏干细胞经特定的分化和增殖培养基诱导培养,培养结束后用抗标志蛋白荧光抗体和CFSE染色,通过荧光显微镜及流式细胞仪测定分化及增殖状况。(4)Cited 2调控机制研究:以慢病毒为载体构建Cited 2敲低和过表达系统,通过慢病毒转染分选得到的心脏干细胞,利用自带GFP标志检测转染效率,转染成功后用puromycin筛选稳定转染的细胞株,加入分化培养基诱导其分化,并检测分化情况。(5)基因表达检测:分离得到的心脏干细胞提取总RNA后,逆转录合成cDNA,进行Real-time PCR和ddPCR,检测基因表达情况。(6)基因表达谱分析:GO分析、KEGG pathway分析。(7)统计方法:采用SPSS19.0统计软件对实验数据进行“独立样本T检验”分析,统计结果以平均值±标准差表示。结果:(1)小鼠心脏干细胞的分离鉴定:我们以Sca-1为核心结合Lin、CD45和CD31三种表面标志物在小鼠心脏组织中发现了 Lin-CD45-Sca-1+CD31-和Lin-CD45-Sca-1+CD31+两个潜在的心脏干细胞亚群,分别占心脏总细胞的0.74±0.03%和3.38±0.30%。体外实验发现,Lin-CD45-Sca-1+CD31-细胞能在体外分化形成心肌细胞、平滑肌细胞和血管内皮细胞,并能在体外增殖,而Lin-CD45-Sca-1+CD31+细胞则不具备分化和自我更新能力,表明Lin-CD45-Sca-1+CD31-细胞是真正的心脏干细胞。micro RNA(miRNA)和mRNA表达谱分析结果显示,与细胞干性相关的20个miRNA和49个mRNA在Lin-CD45-Sca-1+CD31-和Lin-CD45-Sca-1+CD31+两个细胞亚群中呈现相反的表达情况,从分子水平上进一步印证了两者细胞属性的差别。(2)小鼠心脏干细胞功能的年龄相关性变化:老年小鼠Lin-CD45-Sca-1+CD31-心脏干细胞的含量显著高于青年组(0.92±0.06%VS0.74±0.03%,P细胞周期分析也显示,老年组处于S期的心脏干细胞也显著多于青年组(11.86±2.71%VS 7.72±2.64%,P心脏干细胞分化形成心肌细胞(73.40±10.64%VS 40.10±7.84%)、平滑肌细胞(81.24±11.23%VS 54.28±9.07%)和血管内皮细胞(64.85±10.68%VS 37.89±7.47%)的效率明显高于老年组(P心脏干细胞分化的调控:老年小鼠心脏干细胞中Cited 2的表达量较青年组显著下降(P心脏干细胞敲低和过表达Cited 2后,其分化为心肌细胞、平滑肌细胞和血管内皮细胞的能力分别呈现下降和上升趋势。(4)心脏干细胞潜在衰老调控因子筛选:青年和老年小鼠心脏干细胞间有35个基因存在表达差异(FDR细胞增殖、细胞周期、节律调节、肿瘤转录失调、趋化因子信号转导通路、补体途径、NF-kappa B信号通路等有关。结论:(1)小鼠Lin-CD45-Sca-1+CD31-心脏干细胞是真正具有分化和自我更新能力的心脏干细胞,其数量在老年小鼠中增加,但其分化和自我更新能力都显著下降;(2)转录辅助因子Cited 2在成体心脏干细胞功能的调控中可能起较重要的作用;(3)心脏干细胞衰老受到严格的内在机制调节,包括基因转录和表观遗传修饰等。

关键词：心脏干细胞衰老 Cited 2 潜在调控因子

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Nr1d1调控小鼠心脏干细胞衰老的研究

Nr1d1调控小鼠心脏干细胞衰老的研究

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作者：刘琴广西师范大学

学位级别：硕士

目的:心脏干细胞是一类存在于心脏组织中的成体干细胞。随着年龄增长,心脏干细胞的自新和分化能力下降,但是目前对心脏干细胞衰老的分子机制仍不是很明确。Nr1d1是孤儿核激素受体超家族的一员,属于配体激活转录因子,在心脏组织中呈昼夜... 详细信息

目的:心脏干细胞是一类存在于心脏组织中的成体干细胞。随着年龄增长,心脏干细胞的自新和分化能力下降,但是目前对心脏干细胞衰老的分子机制仍不是很明确。Nr1d1是孤儿核激素受体超家族的一员,属于配体激活转录因子,在心脏组织中呈昼夜节律性表达,以血红素依赖的方式参与昼夜节律调节。生物钟紊乱已被证明可加速机体衰老进程。本研究通过分析不同年龄阶段小鼠心脏干细胞的Nr1d1表达变化以及Nr1d1敲低和过表达对心脏干细胞功能的影响,旨在了解和探明Nr1d1在小鼠心脏干细胞衰老中可能的作用及其机制。方法:(1)小鼠心脏干细胞分离:本研究所使用的实验动物为C57BL/6J小鼠。断颈处死实验小鼠,分离心脏并通过机械剪碎及胶原酶Ⅱ处理,制备单细胞悬液。(2)小鼠心脏干细胞分选:新鲜分离的心脏单细胞悬液经荧光标记抗表面标志蛋白抗体组合孵育后,通过流式细胞术分选小鼠心脏干细胞。(3)基因表达分析:通过Real-time PCR检测基因表达情况。(4)Nr1d1表达修饰:用携带Nr1d1-sh RNA或Nr1d1-c DNA的慢病毒转染心脏干细胞,分别敲低或过表达Nr1d1基因。(5)心脏干细胞分化能力检测:利用特定的分化培养基诱导心脏干细胞分化,通过免疫荧光分析检测分化情况。(6)心脏干细胞凋亡检测:细胞经Annexin V和7-AAD染色孵育,流式细胞分析细胞凋亡情况。(7)心脏干细胞增殖能力检测:利用Ed U体外技术测定细胞增殖活性。(8)心脏干细胞周期分析:细胞用7-AAD染色,流式细胞术分析细胞周期时相分布。(9)基因表达谱分析:通过基因芯片法进行,差异表达基因行GO分析和pathway分析。(10)统计方法:使用Graphpad Prism软件对数据进行“one-ANOVA”和“Two-way ANOVA”分析,统计结果以平均值±标准差表示。结果:1)Nr1d1在心脏组织和心脏干细胞中表达的年龄相关性变化。首先分析了Nr1d1在不同年龄阶段小鼠心脏细胞中的表达。结果显示,Nr1d1的表达量随着年龄增加而增加(青年vs老年:1.00±0.00 vs 1.768±0.26,P心脏干细胞中的表达。结果显示老年小鼠心脏干细胞中Nr1d1的表达量较青年组显著上升(青年vs老年:1.00±0.00 vs 9.775±0.2,P心脏组织中特别是在干细胞群中随着年龄的增加而上调。2)Nr1d1表达修饰对心脏干细胞存活的影响。Nr1d1在老年心脏干细胞中呈上调表达。因此,我们针对分离自老年和青年小鼠的心脏干细胞分别进行了Nr1d1敲低和过表达实验,测试下调Nr1d1是否能够逆转老年心脏干细胞的衰老变化或者上调Nr1d1是否导致青年心脏干细胞发生衰老相关变化。首先我们分析了Nr1d1表达水平改变对心脏干细胞凋亡的影响。敲低Nr1d1表达可导致老年小鼠心脏干细胞凋亡程度降低(敲低组vs对照组:25.27±1.08%vs 31.38±0.32%,P心脏干细胞的Nr1d1后,其凋亡率呈现急剧上升(过表达组vs对照组:38.08±0.48%vs 4.37±1.54%,P心脏干细胞的存活中发挥负调控作用。3)Nr1d1表达修饰对心脏干细胞增殖、周期的影响。为更全面的了解Nr1d1在心脏干细胞发育过程中的作用,接着我们分析了Nr1d1表达水平改变对心脏干细胞增殖及周期的影响。结果显示,敲低Nr1d1表达可导致老年心脏干细胞增殖能力升高(敲低组vs对照组:26.4±0.91%vs 21.93±1.19%,P细胞比例增多(敲低组vs对照组:47.1±3.07%vs 32.61±1.4%,P细胞比例增多(敲低组vs对照组:10.89±1.91%vs 4.94±2.46%,P心脏干细胞的Nr1d1后,其增殖能力显著降低(过表达组vs对照组:16.03±1.33%vs30.2±2.16%,P细胞比例减少(过表达组vs对照组:21.51±5.17%vs 44.57±1.58%,P细胞比例减少(过表达组vs对照组:8.78±4.03%vs 19.82±3.71%,P心脏干细胞的周期和增殖。4)Nr1d1表达修饰对心脏干细胞分化能力的影响。为探明Nr1d1对心脏干细胞分化的作用,我们分析了Nr1d1表达水平改变对心脏干细胞分化能力的影响。结果显示,敲低Nr1d1表达后老年小鼠心脏干细胞的分化能力无明显差异;而Nr1d1过表达后青年小鼠心脏干细胞分化为心肌细胞、平滑肌细胞的能力降低,分化为血管内皮细胞的能力无明显差异。这说

关键词： Nr1d1 心脏干细胞衰老分子机制

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CGRP对大鼠急性心肌梗死后心脏干细胞募集及其治疗作用的实验研究

CGRP对大鼠急性心肌梗死后心脏干细胞募集及其治疗作用的实验研究

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作者：曹桎铭遵义医学院

学位级别：硕士

目的急性心肌梗死后移植干细胞的治疗作用已得到广泛认同，但细胞移植尚存在诸多问题，比如扩增周期长、免疫排斥、存活率低、归巢量少、不能与宿主细胞通讯等限制了细胞移植治疗的应用。而心脏自身的固有干细胞（CSC）的特性已在多项... 详细信息

目的急性心肌梗死后移植干细胞的治疗作用已得到广泛认同，但细胞移植尚存在诸多问题，比如扩增周期长、免疫排斥、存活率低、归巢量少、不能与宿主细胞通讯等限制了细胞移植治疗的应用。而心脏自身的固有干细胞（CSC）的特性已在多项研究中得到证实，若能寻找一种能够原位激活或募集CSCs的药物或因子，可能是一种干细胞治疗心肌梗死的新途径。降钙素基因相关肽（CGRP）广泛分布于血管系统，多项研究证实其对间充质干细胞、内皮细胞等具促增殖和迁移作用，并且能上调体内bFGF、IGF-1、HGF等能调控CSC生物学作用的生长因子。因此，我们设想：CGRP对CSCs是否有类似作用，其心血管保护作用是否与CSC有一定关联呢？为了回答这一问题，本实验拟在大鼠体内实验中，直接给予CGRP处理，观察其对CSC是否具有募集作用，并初步探讨其募集CSC的机制和对急性心肌梗死的治疗作用。方法通过结扎左前降支建立大鼠急性心肌梗死模型。将104只健康SD大鼠随机分为假手术组、对照组、CGRP组。假手术组仅开胸，不结扎前降支，对照组在梗死后给予PBS心肌内注射，CGRP组在梗死后按10μg/㎏心肌内注射CGRP。各组于3d、7d、14d、28d处死动物，每个时间点保证每组6只。取得标本后，分别作HE、Masson染色、TTC染色观察心脏形态学改变;超声心动图检测心功能;免疫组织化学观察心肌内血管新生;采用ELISA法检测心肌组织内VEGF水平;免疫荧光染色观察CSC募集情况。结果 1.术后4周HE染色显示假手术组心肌排列整齐有序，无瘢痕组织;对照组大量心肌消失，较多纤维瘢痕组织增生，排列紊乱;CGRP组瘢痕组织明显比对照组少，有较多正常心肌细胞存留。Masson染色显示，假手术组心肌细胞呈红色，未见蓝染之胶原纤维;对照组可见大量蓝色胶原纤维，胶原纤维内细胞核溶解消失，存活心肌细胞少;CGRP组胶原纤维较对照组明显减少。 2.术后4周各组行超声心动图检测LVDd、LVDs、FS和EF值。结果显示，与假手术组相比，对照组及CGRP组的LVDd和LVDs均增大，FS和EF减低;给予CGRP组较对照组以上心功能指标明显改善（P细胞数在第3天即增加，7天达高峰，14天明显减少。其中，各时间点中对照组较假手术组CSC细胞数明显增多（P<0.05），CGRP组较对照组则增加更明显（P<0.05）。结论 1. CGRP可诱导心肌VEGF高表达，促进血管生成，减少梗死面积，改善左室重构和心功能，对急性心肌梗死具有治疗作用。 2. CGRP可促进急性心肌梗死后CSCs在梗死区域募集，并在第7天达高峰,其机制可能与VEGF有关。

关键词：降钙素基因相关肽心脏干细胞血管内皮生长因子心肌梗死

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小鼠C-Kit+心脏干细胞、胚胎干细胞及骨髓间充质干细胞MicroRNAs谱表达对比研究

小鼠C-Kit+心脏干细胞、胚胎干细胞及骨髓间充质干细胞MicroRNAs...

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作者：段茂林泸州医学院

学位级别：硕士

目的:采用MicroRNAs基因芯片检测方法对比研究小鼠C-Kit+心脏干细胞(Cardiac Stem Cells,CSCs)、小鼠胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)和小鼠骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)MicroRNAs谱表达的差异,探索CSCs起源、寻找CSCs特异性表达的MicroRNAs。方法:1.心脏组织块贴壁法获取小鼠CSCs:选取新生(心脏,除去心包组织,心脏剪碎成约1mm3大小组织块,冷磷酸盐缓冲溶液(free phosphate-buffered solution,PBS)清洗,0.25%胰酶+0.1%11型胶原酶37℃消化2min,等体积新鲜完全培养基(complete explant medium,CEM)中和,离心后弃上清液,沉淀新鲜CEM重悬,组织块接种至培养皿,定期更换培养液;2.流式细胞术(FlowCytometry,FCM)分选 C-Kit+CSCs:约 14±2d,CSCs 分化增殖,融合度达40%～50%,PBS液冲洗2次,0.25%胰酶37℃条件下轻柔差速消化5min,收集消化液,等胰酶体积CEM中和,离心(1000r/min,5min)后弃上清,加入 PerCP-CyTM5.5 Rat Anti-Mouse CD117抗体 1mlPBS,4℃孵育约20～30min,离心(1000r/min,5min)后弃上清,PBS液清洗多余抗体后离心2次,加入约1ml PBS,制成流式细胞悬液,交由泸州医学院中心实验室FCM筛选分离;3.复苏、扩增小鼠ESCs和小鼠BMSCs;4.MicroRNAs基因芯片方法检测小鼠C-Kit+ CSCs、小鼠ESCs和小鼠BMSCs的MicroRNAs谱表达差异:小鼠C-Kit+ CSCs、小鼠ESCs及小鼠BMSCs分别提取总RNA,质检提取三类细胞总RNA,后与MicroRNAs芯片杂交,芯片经荧光图像扫描,并筛选出特异性MicroRNAs。结果:1、心脏组织块贴壁培养法获取了较大量小、圆、亮形态CSCs,心肌组织块4±1d开始长出CSCs,细胞铺叠于成纤维细胞之上,形似“泪滴”或“葵花籽,”状,细胞边缘圆润光滑,透光性好,高倍镜下不能观察到细胞核,10±1d,小、圆、亮细胞数量增长迅速,14±2d细胞融合度可达40%～50%,随着CSCs长出,部分组织块被拉伸为月牙状,部分组织块消失;2、CSCs分化出的类心肌样组织可搏动;3、FCM分选C-Kit+CSCs阳性率8.7%±0.6%,分选出的C-Kit+ CSCs在普光镜下呈现分选前小、圆、亮形态,细胞边缘圆润光滑,透光性好,高倍镜下不能观察到细胞核,荧光镜下有不同程度亮度显色;4、在新鲜CEM里,C-Kit+CSCs持续保持小、圆、亮形态,加入条件培养基作为诱导因素,部分C-Kit+CSCs开始长出“伪足”,向长条梭状形态改变,部分C-Kit+CSCs数量开始增加;5、小鼠C-Kit+CSCs、小鼠ESCs和小鼠BMSCs的MicroRNAs 谱比较:C-Kit+CSCs 和 ESCs 比较:上调表达 MicroRNAs有 miR-207,miR-721,miR-21a-5p 等 5 个,下调表达 MicroRNAs 有miR-295-5p,miR-495-5p,miR-381-3p 等 21 个;C-Kit+ CSCs 和 BMSCs比较:上调表达 MicroRNAs 有 miR-1843b-3p,miR-30e-5p,miR-291b-3p 等 34 个,下调表达 MicroRNAs 有 miR-466f-3p,miR-1954,miR-669p-3p 等 27 个;ESCs 和 BMSCs 比较:上调表达MicroRNAs 有 miR-30e-5p,miR-329-3p,miR-291-3p 等 64 个,下调表达 MicroRNAs 有 miR-1954,miR-664-5p,miR-669n 等 20 个。结论:1.心肌组织块贴壁培养法可稳定获取大量C-Kit+CSCs;2.CSCs具有向心肌细胞分化潜能;3.C-Kit可以作为CSCs的筛选标准;4.FCM分选C-Kit+ CSCs阳性率8.7%±0.6%;5.经FCM分选出的C-Kit+CSCs处于“休眠”状态,有活性,保持有增殖和分化能力;6.原代CSCs条件培养基中含有诱导C-Kit+ CSCs增殖和分化的因子;7.小鼠 C-Kit+ CSCs 和小鼠 ESCs,小鼠 BMSCs 比较,MicroRNAs 上调或下调表达(超过1.5倍)的MicroRNAs有一定的创新发现,可能在心脏干细胞的分化和增殖的调控中具有一定作用,具有深入研究的价值;8、从MicroRNAs谱表达差异方面看,CS

关键词：心脏干细胞 BMSCs ESCs C-Kit MicroRNAs

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Tbx3对小鼠心脏干细胞分化的影响

Tbx3对小鼠心脏干细胞分化的影响

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作者：刘铮泸州医学院

学位级别：硕士

目的:通过上调小鼠心脏干细胞(Cardiac stem cells,CSCs)中Tbx3的表达水平,研究Tbx3在小鼠CSCs向起搏样细胞分化过程中的作用。方法:1、小鼠CSCs的分离、培养及传代:取昆明小鼠心脏组织,通过心肌组织块贴壁培养法获取原代小鼠CSCs,待CSC... 详细信息

目的:通过上调小鼠心脏干细胞(Cardiac stem cells,CSCs)中Tbx3的表达水平,研究Tbx3在小鼠CSCs向起搏样细胞分化过程中的作用。方法:1、小鼠CSCs的分离、培养及传代:取昆明小鼠心脏组织,通过心肌组织块贴壁培养法获取原代小鼠CSCs,待CSCs长满约70%培养皿底时,传代并继续培养。2、Tbx3过表达载体的构建:以购买的质粒DNA为模板,PCR扩增Tbx3,重组到质粒载体后完成基因测序,与目的基因序列对比;3、Tbx3过表达慢病毒包装及滴度测定:用构建好的Tbx3过表达载体转染293T细胞,分两次收集病毒并纯化,RT-PCR检测病毒滴度;4、连续观察感染Tbx3过表达慢病毒后CSCs生长情况及形态学变化;5、感染后第3天,RT-PCR检测HCN2、HCN4在mRNA水平的表达,第7天,Western-blot检测HCN4和HCN2蛋白水平的表达。结果:1、组织块培养法培养原代小鼠CSCs:组织块接种4h后开始贴壁,5～7d左右开始在心肌组织块周围长出小、圆、亮的细胞,生长于成纤维细胞上层,胞浆折光性好,高倍镜下未见核仁,14d左右可长满约70%培养皿底,无明显核仁;2、成功构建Tbx3过表达慢病毒,测得病毒滴度为2.09×108 TU/ml;3、Tbx3过表达慢病毒在小鼠CSCs中表达:预实验显示感染复数(multiplicity of infection,MOI)是70的Tbx3过表达慢病毒感染小鼠CSCs72h后,Western-blot实验检测到84KD大小的Tbx3蛋白表达,而空白对照组和阴性对照组小鼠CSCs无Tbx3表达,说明Tbx3过表达慢病毒成功感染小鼠CSCs,并获得高水平表达;4、小鼠CSCs感染Tbx3过表达慢病毒3d后,HCN4 mRNA表达水平较空白对照组上调约20倍(P0.05);5、Western-blot检测结果:感染3天,Tbx3过表达慢病毒的小鼠CSCs及对照组小鼠CSCs在Western blot实验中均未检测到HCN2、HCN4表达。结论:1、组织块贴壁培养法获得小鼠CSCs是稳定、可靠的;2、Tbx3过表达慢病毒感染CSCs的最佳感染复数为70;3、Tbx3在转录水平上调HCN4表达,但不上调HCN2表达;4、单纯上调Tbx3表达未能使CSCs分化为起搏样细胞。

关键词：小鼠心脏干细胞分化 Tbx3 起搏样细胞

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大鼠急性心肌梗死后c-kit+心脏干细胞增殖分化的时序观察

大鼠急性心肌梗死后c-kit+心脏干细胞增殖分化的时序观察

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作者：姜佳慧复旦大学

学位级别：硕士

研究背景：随着近年来我国经济社会的发展,老龄化的提高、饮食结构和生活方式的改变,冠心病的发病率不断增高,虽然目前治疗手段取得了长足的进步,然而这些治疗均不能挽救已经梗死的心肌,从而导致了急性心肌梗死后慢性心功能不全发生率... 详细信息

研究背景：随着近年来我国经济社会的发展,老龄化的提高、饮食结构和生活方式的改变,冠心病的发病率不断增高,虽然目前治疗手段取得了长足的进步,然而这些治疗均不能挽救已经梗死的心肌,从而导致了急性心肌梗死后慢性心功能不全发生率的上升。长期以来人们认为心脏是一个分化终末的器官,而近年来发现心脏存在能够增殖分化干细胞,这使得修复损伤心肌成为可能,而这类细胞中以c-kit+心脏干细胞的修复能力最强。明确在自然病程状态下,急性心肌梗死后c-kit+心脏干细胞的增殖和分化状态对我们进一步认识心脏干细胞、利用干细胞开展治疗有很大帮助,然而至今极少研究涉及这一问题。因此本课题选择在无任何干预状态下观察心脏c-kit+心脏干细胞增生和分化的时序变化。研究目的：本研究采用开胸冠脉结扎法制备大鼠心肌缺血动物模型,利用组织学和免疫荧光技术研究急性心肌梗死后的病理改变,c-kit+阳性心脏干细胞增殖状态、数量、和位置随时间改变的情况,以及这类细胞的最终分化方向。研究方法：选取SD大鼠25只,雌雄不限,有复旦大学上海医院动物实验中心提供,体重170±10g。将动物随分配到5个组（每组各5只）：分别为对照组（假手术组）、急性心肌梗死后1天组、急性心肌梗死后3天组、急性心肌梗死后7天组及急性心肌梗死后28天组。以开胸结扎大鼠冠状动脉左前降支的方法制备大鼠急性心肌梗死模型,对照组仅开胸置缝线,不结扎,术后连续腹腔注射青霉素3天。用肢体导联心电图评估造模成功与否。造模成功后,分别于术后1天、3天、7天及28天,以过量戊巴比妥钠麻醉动物,开胸取心脏,切下梗死心肌后于甲醛溶液中侵泡72小时,后制成石蜡切片,分别进行HE染色、Masson染色、c-kit免疫荧光染色、ki-67免疫荧光染色、GATA4免疫荧光染色,Nkx2.5免疫荧光染色。免疫荧光染色时以PBS代替一抗做阴性对照。用光学纤维镜观察HE染色、Massoon染色切片,己明确急性心肌梗死后心脏组织学改变,荧光显微镜观察免疫荧光片和并采集图片,以观察心脏c-kit心脏干细胞数量、位置及增值状态随时间变化的变化。研究结果：（1）开胸结扎冠状动脉左前降支后,左室前壁苍白,左心耳充血,心室收缩活动减弱,心电图肢体导联ST段抬高,显示模型制备成功。（2）HE及Masson染色显示梗死区位于左室前壁及室间隔前部,梗死部位核消失、肌纤维排列紊乱,炎症细胞浸润,后期纤维结缔组织增生,替代坏死心肌组织,新生毛细血管形成。验证了经典急性缺血后的心肌病例变化。（3）以免疫荧光显微镜观察荧光染色切片,结果提示在坏死相关区域,c-kit阳性表达在心肌梗死1天未见较对照组的明显差异,3天后较对照组显著上升,7天时达到高峰,28天后较对照组无明显差异,c-kit主要表达于缺血坏死相关区域,在未受缺血损伤心肌较对照组无明显差异。Ki-67的表达与c-kit相吻合,在心肌梗死1天未见较对照组的明显差异,3天后较对照组显著上升,7天时达到高峰,28天后较对照组无明显差异,但其表达呈现全心增多,不仅限制于缺血梗死相关区域。GATA4及Nkx2.5的在梗死后早期表达升高,位于核内,梗死晚期其表达下降,主要位于核周。结论：1、本研究通过开胸冠状动脉结扎法成功制作了大鼠急性心肌梗死模型,验证心梗后心脏组织学改变,这一过程以心肌细胞大量坏死、炎症细胞浸润及肉芽组织增生坏死部位纤维化为突出特征,最终导致梗死部位心肌厚度下降,瘢痕形成,收缩功能消失。2、在无外界干预的大鼠急性心肌梗死模型中,早期缺血相关区域c-kit+干细胞增殖分裂,于心肌梗死后第7天达到高峰,28天后基本恢复正常状态,这些c-kit+细胞向心肌组织分化,最终可形成新生心肌,c-kit*心脏干细胞在非缺血损伤区无明显增生。而在非缺血损伤区域心肌组织内也有细胞增生分裂的现象,其随时间的变化类似于c-kit心脏干细胞,具体原因尚不明确,这可能与梗死心肌及炎症反应释放大量细胞因子造成成纤维细胞增生,循环干细胞归巢等有关,应进一步明确这些增殖细胞的种类和性质。

关键词：急性心肌梗死心脏干细胞大鼠

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