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心脏干细胞分泌的exosome对氧化应激下心肌细胞的保护作用研究

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中国药理学通报 2015年第12期31卷 1656-1660页

作者：肖静潘宇李晓红姜霖杨翔宇吴岳恒雷和平余细勇南方医科大学药学院广东广州510515 广东省人民医院广东省医学科学院广东广州510080

目的探索心脏干细胞分泌的外泌体(exosome)对体外氧化应激所致心肌细胞凋亡的保护作用。方法磁珠分选出Sca-1^+CPCs进行培养,流式细胞术鉴定;分离CPCs分泌的exosome,并用Western blot进行表型鉴定和用Nanosight进行粒径分析;免疫荧光法... 详细信息

目的探索心脏干细胞分泌的外泌体(exosome)对体外氧化应激所致心肌细胞凋亡的保护作用。方法磁珠分选出Sca-1^+CPCs进行培养,流式细胞术鉴定;分离CPCs分泌的exosome,并用Western blot进行表型鉴定和用Nanosight进行粒径分析;免疫荧光法及PKH26标记技术观察心肌细胞H9c2对exosome的摄取作用;通过H_2O_2处理诱导H9c2细胞凋亡,用Western blot检测对照组与CPC-exo处理组凋亡相关蛋白水平,观察exosome对心肌细胞凋亡的保护作用。结果 1磁珠分选出的细胞用免疫荧光检测发现Sca-1呈阳性表达,且纯度可达95%以上。2从Sca-1^+CPCs细胞培养上清中提取出的exosome其表面标记蛋白CD63呈阳性表达,Nanosight结果显示大部分粒子都处于(82.33±3.06)nm(n=3)。免疫荧光显示H9c2细胞中可见大量PKH26标记的exosome在胞质聚集。3Western blot结果显示,与对照组相比,CPC-exo处理组总的caspase-3表达不变,而激活型caspase-3表达水平明显降低(P细胞所摄取,可以保护心肌细胞由于氧化应激引起的凋亡。

关键词：心脏干细胞外泌体磁珠分选旁分泌效应氧化应激凋亡

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心脏干细胞分离培养及其增殖与迁移的机制

中国组织工程研究 2016年第41期20卷 6190-6196页

作者：侯波朱先云王学坤青岛市胶州中心医院心内科山东省青岛市266300 青岛市胶州中心医院内分泌科山东省青岛市266300 青岛市中心医院心内科山东省青岛市266042

背景:体外环境下进行心脏干细胞培养的过程中,生长微环境可能会对细胞的的增殖等产生一定的影响。目的:在体外环境下培养大鼠心脏干细胞,探讨心脏干细胞增殖、迁移的可能机制。方法:纳入SD大鼠10只,获得心肌组织块进行原代和传代培养。... 详细信息

背景:体外环境下进行心脏干细胞培养的过程中,生长微环境可能会对细胞的的增殖等产生一定的影响。目的:在体外环境下培养大鼠心脏干细胞,探讨心脏干细胞增殖、迁移的可能机制。方法:纳入SD大鼠10只,获得心肌组织块进行原代和传代培养。收集第3代心脏干细胞进行免疫荧光染色,进行干细胞鉴定,检测干细胞生长因子受体(c-kit)和CD45、CD90的表达。收集培养后的组织块,随机分为2份,一份用多聚甲醛进行固定,常规石蜡包埋后切片,进行苏木精-伊红染色、Masson染色以及细胞凋亡检测;另一份在培养基中添加Ed U标记增殖细胞,采用免疫荧光染色检测c-kit阳性细胞以及基质金属蛋白酶2,9及转化生长因子β1等表达。结果与结论:(1)细胞鉴定结果:心肌组织培养7-10 d后有明亮的圆形细胞长出,细胞贴壁后呈梭状,生长、增殖能力旺盛。免疫荧光染色可观察到大量细胞呈c-kit、CD45阳性表达,CD90阴性表达;(2)细胞凋亡情况:培养的组织块切片后染色见大量新生细胞生长的同时伴随心肌细胞的凋亡;(3)免疫荧光染色结果:经EdU标记后阳性细胞分布于心肌间隙,基质金属蛋白酶2,9及转化生长因子β1少量表达,但周围心肌组织上述3因子表达明显增多。(4)结果表明,心肌组织体外培养可获取心脏干细胞,伴随细胞增殖和迁移,其机制与基质金属蛋白酶2,9及转化生长因子β1的表达有关。

关键词：干细胞培养心脏干细胞心脏细胞稳态微环境作用机制

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心脏干细胞的研究进展

中华心血管病杂志 2009年第8期37卷 758-761页

作者：宋雷杨跃进中国医学科学院北京协和医学院阜外心血管病医院冠心病诊治中心 100037

传统观点认为心脏是终末分化器官，心脏细胞数目在出生后固定且终生不再增加，损伤后没有内源性再生能力，因此目前治疗手段局限于改善现有的心肌细胞功能。但日益增多的证据已对这一概念提出挑战，研究者分别在梗死后心肌、晚期缺血性... 详细信息

传统观点认为心脏是终末分化器官，心脏细胞数目在出生后固定且终生不再增加，损伤后没有内源性再生能力，因此目前治疗手段局限于改善现有的心肌细胞功能。但日益增多的证据已对这一概念提出挑战，研究者分别在梗死后心肌、晚期缺血性心脏病及扩张型心肌病患者心脏中检测到心肌细胞有丝分裂表现。Hiedihy等于2002年首次发现心脏包含一群内源性干细胞，有自我更新及多向分化能力，负责维持心脏内环境稳态，这类细胞被称为心脏干细胞（cardiac stem cells，CSC）。此后很多实验室已经在人类或其他哺乳动物成熟心脏中分离出CSC，但其在何种程度上参与心脏的生理及病理过程，有何生物学特性，能否用于临床等更多问题随之而来，本文就此综述如下。

关键词：心脏干细胞心肌细胞功能扩张型心肌病患者晚期缺血性心脏病细胞有丝分裂内环境稳态 cells 生物学特性

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心脏干细胞治疗心血管疾病的研究进展

中国胸心血管外科临床杂志 2017年第12期24卷 983-987页

作者：吕井井施国丞陈会文上海儿童医学中心胸外科上海200127

随着干细胞研究的深入,人们发现心脏像皮肤、脑、肝脏等组织一样,也属于可再生器官,自身也存在干细胞即心脏干细胞,具有干细胞共有的自我更新、克隆形成、定向分化成心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞的特性。由于具有组织特异性及心系定... 详细信息

随着干细胞研究的深入,人们发现心脏像皮肤、脑、肝脏等组织一样,也属于可再生器官,自身也存在干细胞即心脏干细胞,具有干细胞共有的自我更新、克隆形成、定向分化成心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞的特性。由于具有组织特异性及心系定向分化潜能,心脏干细胞在心血管疾病治疗方面较其他干细胞具有明显的优势,但存在心脏干细胞移植率低等问题。为了克服上述不足,近年来,人们又开始探索将细胞疗法与一些新技术相结合治疗心血管疾病,如细胞疗法与组织工程、基因疗法、心脏干细胞外泌体的联合应用等,为心血管疾病的治疗提供了新思路。本文主要针对心脏干细胞治疗心血管疾病机制及目前心脏干细胞与新技术的联合应用进展进行综述。

关键词：心脏干细胞细胞疗法心肌再生心血管疾病

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心脏干细胞移植治疗缺血性心脏病的研究进展

中国循环杂志 2015年第3期30卷 290-292页

作者：李玲石蓓遵义医学院附属医院心血管内科贵州省遵义市563003

缺血性心脏病患者往往死于心力衰竭(心衰),而目前对于难治性心衰最好的治疗方法是心脏移植。但随着干细胞和祖细胞在再生潜能治疗和预防心衰方面的深入研究,心脏干细胞移植有望成为治疗缺血性心脏病最理想的方法。本文旨在对心脏干细胞... 详细信息

缺血性心脏病患者往往死于心力衰竭(心衰),而目前对于难治性心衰最好的治疗方法是心脏移植。但随着干细胞和祖细胞在再生潜能治疗和预防心衰方面的深入研究,心脏干细胞移植有望成为治疗缺血性心脏病最理想的方法。本文旨在对心脏干细胞移植治疗缺血性心脏病的研究现状及所面临的问题进行综述。

关键词：心脏干细胞缺血性心脏病干细胞移植

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心脏干细胞年龄、性别及部位分布特征研究

心脏干细胞年龄、性别及部位分布特征研究

作者：吕定超山西医科大学

学位级别：硕士

背景:心肌梗死（myocardial infarction,MI）是由于为心脏供血的冠状动脉堵塞,而导致心肌细胞缺血坏死的一种严重危害人类健康的高风险、高死亡的疾病。目前针对心肌梗死的治疗主要包括:药物治疗、介入治疗以及外科冠状动脉旁路搭桥术,... 详细信息

背景:心肌梗死（myocardial infarction,MI）是由于为心脏供血的冠状动脉堵塞,而导致心肌细胞缺血坏死的一种严重危害人类健康的高风险、高死亡的疾病。目前针对心肌梗死的治疗主要包括:药物治疗、介入治疗以及外科冠状动脉旁路搭桥术,但是这些治疗方法均仅仅能够起到恢复局部心肌的血液供应,延缓心肌梗死后不利的心肌重塑的作用,而并不能从根本上解决心肌梗死后心肌数目减少、心脏功能进行性下降这一心肌梗死后的根本问题。我们及他人的研究表明,心脏中存在着心脏干细胞（cardiac stem cells,CSCs）,它可以分化成心肌细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞等,并可以修复损伤的心肌组织。本研究拟从基础性研究角度观察小鼠心脏干细胞各亚群的年龄分布及性别分布情况,同时对各干细胞亚群在心脏不同部位中的分布情况进行初步检测,为临床干细胞治疗心肌梗死寻找新的靶点。目的:本研究拟从基础性研究角度观察小鼠心脏干细胞各亚群的年龄分布及性别分布情况,同时对各干细胞亚群在心脏不同部位中的分布情况进行初步检测,为临床干细胞治疗心肌梗死寻找新的靶点。方法:1、利用免疫磁珠活性分选法获得的C57小鼠心脏干细胞,并利用流式细胞仪进行细胞纯度鉴定;对分选的心脏干细胞行细胞培养并观察其定向分化的能力。2、利用流式细胞技术分析4周龄青年C57小鼠与9月龄老年C57小鼠各9只心脏干细胞的含量;分析6月龄健康成年雌性、雄性各9只C57小鼠心脏干细胞的含量;分析9只6月龄健康成年C57小鼠心房、左心室、右心室以及室间隔的心脏干细胞含量。结果:1 C57小鼠心脏干细胞的活性分选及鉴定1.1磁珠分选法获得的C57小鼠CD45-、Sca-1+干细胞流式细胞仪纯度鉴定Lagendorff装置灌流、消化酶解心肌细胞,经30μm滤网过滤后的小细胞,经Sca-1及CD45抗体孵育后,用流式细胞仪检测CD45-、Sca-1+细胞百分比。经检测发现,纯化后的CD45-、Sca-1+细胞百分比高达86.4%,细胞纯化技术稳定。1.2分离培养的心脏干细胞具有多向分化能力从正常6月龄成年雄性C57小鼠心脏中分离、提取心脏干细胞,培养基中培养14天,然后固定细胞进行免疫荧光染色,发现:干细胞已向特定细胞类型开始分化。分别用肌钙蛋白（troponin I,红色）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA,红色）、von Willebrand因子（v WF,绿色）作为心肌细胞、成纤维细胞及内皮细胞的标记物（细胞核用DAPI标记为蓝色）,见图。证明分离培养的心脏干细胞确实具有定向分化为心脏组织细胞的能力,即分离的心脏干细胞成功。2 C57小鼠心脏干细胞的年龄、性别及部位分布2.1 C57小鼠ckit+心脏干细胞与sca-1+心脏干细胞含量比较选择6月龄成年雄性C57小鼠9只,分别使用流式细胞技术测定其心脏中ckit+心脏干细胞与sca-1+心脏干细胞含量（%）。结果发现ckit+CSCs含量明显少于sca-1+CSCS含量。（0.19±0.027 vs 21.37±3.378,P＜0.05）。2.2不同年龄C57小鼠ckit+、sca-1+心脏干细胞含量比较选择4周龄和9月龄的雄性C57小鼠各9只,分别作为青年组和老年组,使用流式细胞技术测定其心脏中ckit+心脏干细胞与sca-1+心脏干细胞含量（%）。结果发现青年组ckit+心脏干细胞含量（%）多于老年组（0.24±0.036 vs 0.16±0.057,P＜0.05）;而老年组sca-1+心脏干细胞含量（%）明显多于青年组（25.41±4.689 vs20.41±5.213,P＜0.05）;由于sca-1+心脏干细胞含量明显高于ckit+心脏干细胞,所以总体来说老年组心脏干细胞含量（%）明显高于青年组（23.67±6.431 vs 20.21±3.452,P＜0.05）。2.3不同性别C57小鼠ckit+、sca-1+心脏干细胞含量比较选择6月龄成年C57小鼠雌雄各9只,分别作为雌性组和雄性组,使用流式细胞技术测定其心脏中ckit+心脏干细胞与sca-1+心脏干细胞含量（%）。结果发现雌性组ckit+心脏干细胞含量（%）与雄性组差别无统计学意义（0.19±0.034 vs 0.18±0.045,P＞0.05）;同时雌性组sca-1+心脏干细胞含量（%）与雄性组差别亦无统计学意义（22.35±3.423 vs 21.90±4.322,P＞0.05）;所以总体来说雌性组及雄性组心脏干细胞含量显著差异（21.37±6.231 vs 20.21±2.322,P＞0.05）。2.3 C57小鼠心脏不同部位ckit+、sca-1+心脏干细胞含量比较选择6月龄成年雄性C57小鼠9只,将其心脏分为心房,左心室,右心室,室间隔四个部分作为4组,分别使用流式细胞技术测定其心脏中ckit+心脏干细胞与sca-1+心脏干细胞含

关键词：心脏干细胞缺血性心脏病衰老心肌再生

心脏干细胞分泌的外泌体对氧化应激损伤下心肌细胞保护性作用的机制研究

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心脏干细胞分泌的外泌体对氧化应激损伤下心肌细胞保护性作用的机...

作者：肖静南方医科大学

学位级别：硕士

心血管系统疾病是威胁人类生命的主要疾病之一。心肌缺血性疾病如动脉粥样硬化、心肌缺血再灌注损伤以及心力衰竭等都有一个相同的病理改变,即在病变的区域产生大量的活性氧（reactive oxygen species, ROS）,活性氧的累积会造成心肌细... 详细信息

心血管系统疾病是威胁人类生命的主要疾病之一。心肌缺血性疾病如动脉粥样硬化、心肌缺血再灌注损伤以及心力衰竭等都有一个相同的病理改变,即在病变的区域产生大量的活性氧（reactive oxygen species, ROS）,活性氧的累积会造成心肌细胞的凋亡和坏死,进而加速心脏疾病的病理进程。因此,研究者们正在急切地寻求一个有效的治疗手段来缓解氧化应激对心血管系统的损伤。干细胞移植在缺血性心肌病的治疗中具有广泛的应用前景,不同来源的干细胞的移植都被证实可以在不同程度上提高心功能,其中包括成体自体心脏固有的干细胞——心脏干（祖）细胞（Cardiac progenitor cells, CPCs）,由于其来源于自体的组织,可以很好地避免异体移植排斥效应,因此越来越受众多研究者关注。但是,心脏干细胞对于心肌保护的作用的机制目前还有待进一步阐明,通常移植后干细胞的常规生理过程包括：干细胞注射到病变区域、着床、分化,然后替代损伤的心肌组织。尽管干细胞直接的分化作用和间接的旁分泌效应都已经被证实是干细胞心肌修复作用的潜在机制,但是近几年来越来越多的证据显示移植后的干细胞效应主要来自于干细胞的旁分泌作用,干细胞可以分泌出多种旁分泌因子,这些因子在减少原有的心肌损伤和促进受损区域细胞的修复能力等方面都具有重要作用。过去的几年中,许多研究者证实CPCs分泌的一种名叫外泌体（exosomes）的双层膜的纳米级细胞外囊泡可以显著改善受损心脏的心功能。Exosomes是一种直径在30-100nm的膜性囊泡,是囊泡转运家族的重要组成部分,可以将里面包裹的众多转录因子、小非编码RNA （microRNA, miRNAs）、长链非编码（long non-coding RNA） RNA （lncRNA）等成分通过与目的细胞融合的方式传递到靶细胞中,进而调控细胞中一些重要的信号通路。CPCs通过分泌exosomes,携带一些CPC中可以改善心肌损伤重要因子,传递到心肌细胞内,从而发挥心肌保护作用。但是exosomes的内容物会根据病理条件的不同而发生改变,不同的因子就会导致靶细胞会有不同的命运。因此,对于处在特定病理条件下的exosomes内容物的探究非常必要且有意义,特别是在氧化应激损伤的情况下,CPCs到底分泌的带有何种因子的exosomes可以保护心肌细胞,进而改善心功能?在exosomes所有的内容物中,miRNAs被证实在心梗等心肌缺血性疾病中控制着某些重要的病理生理转归,这种单链的、由大约22个核苷酸组成的非编码RNAs参与到众多基因转录后翻译的调控中。MiRNAs可以抑制或者促进心肌细胞的凋亡,也可以调控活性氧导致的心脏疾病。但是CPCs分泌的exosomes在氧化应激的病理微环境下是否都可以保护心肌细胞?而exosomes中的miRNAs在这个过程中又发挥了怎样的角色?因此,本研究主要探究CPCs分泌的外泌体中对于活性氧累积导致的心肌损伤中发挥关键作用的miRNAs以及其调控机制。研究方法：1.采用干细胞表面抗原（stem cell antigen-1, Sca-1）标记免疫磁珠,分选带有这种特定表型的成年小鼠的心脏干细胞,用免疫荧光鉴定其表型,流式细胞术分析分选前后Sca-1阳性的细胞比例;收集CPCs培养48h后的培养上清,用ExoQuick外泌体提取液对CPCs分泌的exosomes进行提取,用纳米粒子示踪仪（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）对exosomes进行粒径分布以及浓度的分析,透射电镜进一步观察exosomes的超微结构,最后用Western blot对其表面标记（CD9、CD63、Alix）进行定性鉴定;免疫荧光检测H9C2细胞对膜染料PHK-26标记后的exosomes的摄取情况;2.用过氧化氢模拟心肌受损时氧化应激的环境,确定过氧化氢的浓度,处理CPC,NTA分析用该浓度过氧化氢处理前后分泌exosomes量的差异;选择13个与本研究相关的miRNAs, RT-qPCR解析在exosomes里面可能包含的miRNAs,并比较氧化应激刺激前后exosomes内的miRNAs的差异（miR-X）;3.用RT-qPCR检测miR-X在氧化应激损伤的心肌细胞中表达差异,TargetScan预测差异miR-X的靶基因,转染miR-X模拟物和抑制物Western Blot检测靶蛋白的变化,验证miR-X与靶蛋白相互调节在心肌细胞氧化应激导致损伤的作用,采用双荧光素酶报告基因实验对miR-X与靶蛋白的直接结合效应进行验证;4.分别用CPC共培养、正常exosomes和过氧化氢刺激后的exosomes预处理心肌细胞,再对心肌细胞进行氧化应激损伤处理,RT-qPCR检测miR-X的改变,WB检测细胞中miR-X的靶蛋白和凋亡相关蛋白caspase-3的表达水平,流式细胞仪检测Annexin V/PI

关键词：缺血性心肌病外泌体心脏干细胞氧化应激 miR-21 细胞程序性死亡因子4

心脏干细胞可通过旁分泌exosome保护心肌细胞发生凋亡

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中国病理生理杂志 2015年第10期 1819-1820页

作者：肖静潘宇李晓红吴岳恒姜霖杨翔宇余细勇广东省人民医院广东省医学科学院医学研究中心南方医科大学广州医科大学药学院

心脏干细胞移植在心肌梗死治疗中具有广泛应用,外泌体(exosome)被认为是细胞旁分泌的重要介质。本研究拟建立心脏固有干细胞(CPCs)的成熟分离方法,并初步探索CPCs分泌的exosome在体外保护氧化应激状态下心肌细胞的凋亡。原代

关键词：旁分泌 exosome 心肌细胞心脏干细胞凋亡

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心脏干细胞的分离技术

中华病理学杂志 2010年第8期39卷 555-556页

作者：刘聪况东王国平华中科技大学同济医学院附属同济医院病理研究所武汉430030

干细胞再生为心肌组织的研究及心肌梗死的修复带来了新的曙光。近期的研究表明，在成年人和哺乳动物心脏内，均存在原始的、未分化的干细胞，该细胞c-kit阳性，被命名为心脏干细胞（cardiacstemceils）^[1-3]。心脏干细胞在体内外被证... 详细信息

干细胞再生为心肌组织的研究及心肌梗死的修复带来了新的曙光。近期的研究表明，在成年人和哺乳动物心脏内，均存在原始的、未分化的干细胞，该细胞c-kit阳性，被命名为心脏干细胞（cardiacstemceils）^[1-3]。心脏干细胞在体内外被证实可分化为心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，并重构心肌组织，改善心功能。

关键词：心脏干细胞分离技术心肌组织干细胞再生 c-kit 平滑肌细胞心肌梗死哺乳动物