心脏干细胞分泌的外泌体对氧化应激损伤下心肌细胞保护性作用的机制研究

作     者：肖静 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：余细勇

授予年度：2016年

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：缺血性心肌病 外泌体 心脏干细胞 氧化应激 miR-21 细胞程序性死亡因子4 

摘      要：心血管系统疾病是威胁人类生命的主要疾病之一。心肌缺血性疾病如动脉粥样硬化、心肌缺血再灌注损伤以及心力衰竭等都有一个相同的病理改变,即在病变的区域产生大量的活性氧（reactive oxygen species, ROS）,活性氧的累积会造成心肌细胞的凋亡和坏死,进而加速心脏疾病的病理进程。因此,研究者们正在急切地寻求一个有效的治疗手段来缓解氧化应激对心血管系统的损伤。干细胞移植在缺血性心肌病的治疗中具有广泛的应用前景,不同来源的干细胞的移植都被证实可以在不同程度上提高心功能,其中包括成体自体心脏固有的干细胞——心脏干（祖）细胞（Cardiac progenitor cells, CPCs）,由于其来源于自体的组织,可以很好地避免异体移植排斥效应,因此越来越受众多研究者关注。但是,心脏干细胞对于心肌保护的作用的机制目前还有待进一步阐明,通常移植后干细胞的常规生理过程包括：干细胞注射到病变区域、着床、分化,然后替代损伤的心肌组织。尽管干细胞直接的分化作用和间接的旁分泌效应都已经被证实是干细胞心肌修复作用的潜在机制,但是近几年来越来越多的证据显示移植后的干细胞效应主要来自于干细胞的旁分泌作用,干细胞可以分泌出多种旁分泌因子,这些因子在减少原有的心肌损伤和促进受损区域细胞的修复能力等方面都具有重要作用。过去的几年中,许多研究者证实CPCs分泌的一种名叫外泌体（exosomes）的双层膜的纳米级细胞外囊泡可以显著改善受损心脏的心功能。Exosomes是一种直径在30-100nm的膜性囊泡,是囊泡转运家族的重要组成部分,可以将里面包裹的众多转录因子、小非编码RNA （microRNA, miRNAs）、长链非编码（long non-coding RNA） RNA （lncRNA）等成分通过与目的细胞融合的方式传递到靶细胞中,进而调控细胞中一些重要的信号通路。CPCs通过分泌exosomes,携带一些CPC中可以改善心肌损伤重要因子,传递到心肌细胞内,从而发挥心肌保护作用。但是exosomes的内容物会根据病理条件的不同而发生改变,不同的因子就会导致靶细胞会有不同的命运。因此,对于处在特定病理条件下的exosomes内容物的探究非常必要且有意义,特别是在氧化应激损伤的情况下,CPCs到底分泌的带有何种因子的exosomes可以保护心肌细胞,进而改善心功能?在exosomes所有的内容物中,miRNAs被证实在心梗等心肌缺血性疾病中控制着某些重要的病理生理转归,这种单链的、由大约22个核苷酸组成的非编码RNAs参与到众多基因转录后翻译的调控中。MiRNAs可以抑制或者促进心肌细胞的凋亡,也可以调控活性氧导致的心脏疾病。但是CPCs分泌的exosomes在氧化应激的病理微环境下是否都可以保护心肌细胞?而exosomes中的miRNAs在这个过程中又发挥了怎样的角色?因此,本研究主要探究CPCs分泌的外泌体中对于活性氧累积导致的心肌损伤中发挥关键作用的miRNAs以及其调控机制。研究方法：1.采用干细胞表面抗原（stem cell antigen-1, Sca-1）标记免疫磁珠,分选带有这种特定表型的成年小鼠的心脏干细胞,用免疫荧光鉴定其表型,流式细胞术分析分选前后Sca-1阳性的细胞比例;收集CPCs培养48h后的培养上清,用ExoQuick外泌体提取液对CPCs分泌的exosomes进行提取,用纳米粒子示踪仪（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）对exosomes进行粒径分布以及浓度的分析,透射电镜进一步观察exosomes的超微结构,最后用Western blot对其表面标记（CD9、CD63、Alix）进行定性鉴定;免疫荧光检测H9C2细胞对膜染料PHK-26标记后的exosomes的摄取情况;2.用过氧化氢模拟心肌受损时氧化应激的环境,确定过氧化氢的浓度,处理CPC,NTA分析用该浓度过氧化氢处理前后分泌exosomes量的差异;选择13个与本研究相关的miRNAs, RT-qPCR解析在exosomes里面可能包含的miRNAs,并比较氧化应激刺激前后exosomes内的miRNAs的差异（miR-X）;3.用RT-qPCR检测miR-X在氧化应激损伤的心肌细胞中表达差异,TargetScan预测差异miR-X的靶基因,转染miR-X模拟物和抑制物Western Blot检测靶蛋白的变化,验证miR-X与靶蛋白相互调节在心肌细胞氧化应激导致损伤的作用,采用双荧光素酶报告基因实验对miR-X与靶蛋白的直接结合效应进行验证;4.分别用CPC共培养、正常exosomes和过氧化氢刺激后的exosomes预处理心肌细胞,再对心肌细胞进行氧化应激损伤处理,RT-qPCR检测miR-X的改变,WB检测细胞中miR-X的靶蛋白和凋亡相关蛋白caspase-3的表达水平,流式细胞仪检测Annexin V/PI双染后处于各时期细胞的比例,反映细胞的凋亡水平。结果：1.原代培养的CPCs形态呈不规则的梭形,流式细胞仪对分选前后的细胞进行表面标记物Sca-1阳性比例的分析,结果显示,分选后Sca-1+细胞的比例较分选前显著增加（95.04±4.29% vs.1.31±0.42%）,免疫荧光结果提示,分选后CPC几乎全部表达分选标记Sca-1蛋白;CPCs培养上清离心之后有明显白色沉淀沉积于管底,NTA结果检测出exosomes的粒径分布范围以及浓度,结果发现大部分粒子都处于exosomes直径的范围（30-100nm）,含量最多的粒子直径约为83nm,浓度为9.16×109个/m1.投射电镜检测到双层膜的直径在100nm左右的囊性小泡,进一步用Western Blot分析该白色沉淀发现,我们所提取出的物质阳性表达CD63、CD9、Alix蛋白;exosomes被PKH26标记后,与H9C2细胞中共孵育12h后,免疫荧光可见大量红色物质在胞浆聚集;2.随着过氧化氢处理浓度增加,细胞形态发生明显变化光,镜下可见细胞皱缩漂浮甚至死亡,用Western Blot发现cleaved caspase-3表达明显增加,100μM效果明显,且细胞无致死性损伤,因此本研究采用100μMH2O2作为氧化应激损伤浓度。Exosomes的NTA计数结果显示,与正常CPC （Nor-CPC）相比（（1.31±0.29）×109）,100μM H202可以促使CPCs （H2O2-CPC）分泌较多的exosomes（（3.36±0.66）×109）;qPCR结果显示,可以在Nor-CPC的exosomes （Nor-exo）和H2O2-CPC的exosomes （H2O2-exo）成功扩增出6个相关的miRNAs（miR-21,24,214,132,195,210）,且miR-21在Nor-exo和H2O2-exo表达水平具有显著性差异;对转染miR-21的模拟物和抑制物后,Western blot结果显示,过表达miR-21后激活型caspase-3的表达显著下调,而抑制miR-21.的表达可显著上调激活型caspase-3,提示miR-21在H9C2细胞中是重要的抗过氧化氢诱导的凋亡因子。3. Target Scan预测出,在不同种属来源的PDCD4 mRNA的3’UTR的不同区域,都有一段相对保守的miR-21的结合位点。Western blot结果发现,心肌细胞中PDCD4的表达水平随着过氧化氢处理浓度的增加而表达上调。并且在过表达miR-21后,PDCD4的表达受到显著抑制,而抑制miR-21后PDCD4表达上调;荧光素酶报告基因发现,转染了野生型的PDCD4载体同时又过表达细胞内miR-21的细胞中,荧光素酶的活性显著降低,证实miR-21与PDCD4是通过直接的结合而发挥抑制作用。4.在氧化应激处理之前给予exosomes进行预保护后,exosomes可以明显提高细胞中miR-21的水平,且细胞中cleaved caspase-3和PDCD4的蛋白水平明显降低。Annexin V/PI双染流式分析,结果发现,与H2O2-ctrl组33.29%的凋亡率相比较,H2O2-exo预保护细胞的凋亡率降低至13.58%,而Nor-exo的预保护也有一定作用,但凋亡率只降低至17.39%,不如H2O2-exo预保护作用明显。结论：1.成年小鼠CPCs含量有限,用免疫磁珠特异性结合的方式可以分离出纯度较高、且较为特异的Sca-1+的心脏干细胞,CPCs同大多数细胞类型一样,可以分泌出exosomes,且分泌exosomes的浓度与内容物会根据细胞所处微环境的变化而改变;并且exosomes可以被H9C2细胞所摄取;2.氧化应激刺激下的CPCs分泌较多exosomes,并且其中的miR-21出现显著差异;氧化应激可以引起心肌细胞凋亡,且发生凋亡时miR-21显著降低,说明miR-21与氧化应激导致的心肌细胞的凋亡密切相关;3. PDCD4作为miR-21的靶基因,参与到miR-21调控的凋亡过程之中,正常细胞受到miR-21对PDCD4的抑制调控,一旦发生氧化应激的刺激,细胞miR-21下降导致PDCD4抑制被解除,进而使细胞容易发生凋亡;4.氧化应激刺激CPCs后分泌的Exosomes的预保护可明显缓解心肌细胞由于氧化应激所致的凋亡,与这种exosomes中包含大量的miR-21密切相关,大量的miR-21传递到心肌细胞后重建了心肌细胞内的miR-21/PDCD4负调节,降低细胞中PDCD4的表达,进而缓解心肌细胞凋亡。因此,本研究主要阐明了心脏干细胞分泌的exosomes在缺血性心肌损伤的疾病模型中对于心肌细胞的保护性作用,首次提出干细胞心肌修复作用的系统性机制是通过exosomes传递miR-21到心肌细胞中调控PDCD4来完成的,为阐明干细胞治疗心肌梗死的作用机制提供了新的视野,并有可能开辟一个潜在的非细胞治疗策略。