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巨噬细胞KLF5调控心肌细胞衰老

巨噬细胞KLF5调控心肌细胞衰老

作者：李敏河北医科大学

学位级别：硕士

目的:研究巨噬细胞KLF5影响心肌细胞的衰老的功能及其分子机制。KLF5是KLFs家族中的一员,它在调节各种细胞生物学过程起着关键作用,包括增殖﹑迁移﹑分化﹑生长﹑存活和凋亡。KLF5作为心脏的一个关键转录因子,在心血管系统中高表达,介... 详细信息

目的:研究巨噬细胞KLF5影响心肌细胞的衰老的功能及其分子机制。KLF5是KLFs家族中的一员,它在调节各种细胞生物学过程起着关键作用,包括增殖﹑迁移﹑分化﹑生长﹑存活和凋亡。KLF5作为心脏的一个关键转录因子,在心血管系统中高表达,介导心脏结构和功能相关的基因表达。CircRNA是一类非常稳定的新型非编码RNA,是5′端帽或3′端聚(A)尾部缺少闭合连续的环状结构。CircRNA比线性RNA稳定,不受RNA外切酶、脱帽或腺基化的影响。有研究证明,某些circRNA可作为有效的mi RNA海绵发挥作用,并具有潜在调控功能。大量文献报道,circRNA可以作为信息传递分子,参与不同细胞之间的相互作用。心肌细胞、心肌巨噬细胞和心肌成纤维细胞是心肌组织的主要细胞类型。我们的研究发现,平滑肌细胞过表达KLF5能促进巨噬细胞迁移,从而促进以平滑肌病变为主的动脉瘤的形成。因此,我们推测巨噬细胞KLF5的变化也可能通过某种途径,例如circRNA,影响心肌细胞从而参与心肌细胞缺氧损伤过程,且可能成为心肌细胞缺氧损伤治疗的靶点。因此,本文主要研究巨噬细胞中KLF5是否参与缺氧诱导的心肌细胞的衰老及其分子机制。方法:1. 骨髓来源的巨噬细胞分为常氧组和缺氧组,用CCK-8检测巨噬细胞增殖情况。2.将心肌细胞分为四组:心肌细胞中加入混合培养基(10%的FBS培养基与KLF5或者Ad-GFP常氧的巨噬细胞培养基4:1混合)常氧培养;心肌细胞中加入混合培养基(10%的FBS培养基与KLF5或者Ad-KLF5常氧的巨噬细胞培养基4:1混合)常氧培养;心肌细胞中加入混合培养基(10%的FBS培养基与KLF5或者Ad-GFP缺氧的巨噬细胞培养基4:1混合)缺氧培养;心肌细胞中加入混合培养基(10%的FBS培养基与KLF5或者Ad-KLF5缺氧的巨噬细胞培养基4:1混合)缺氧培养。CCK-8检测心肌细胞的细胞活力;β-半乳糖苷酶检测心肌细胞的衰老情况;鬼笔环肽检测心肌细胞肌丝分布情况;Western Blot检测缺氧早期抑制衰老和凋亡基因的表达;RT-PCR检测心肌细胞中P21、P16、Caspase3、circ-KHK、circ-dnmt3a、circ-HIF1α、circ-FOXO1的表达水平。结果:1. 缺氧早期促进骨髓来源小鼠巨噬细胞增殖将骨髓来源的巨噬细胞分为常氧组和缺氧组,CCK-8结果显示,缺氧6-26小时显著促进巨噬细胞增殖,但是缺氧48小时之后,巨噬细胞增殖活性受到显著的抑制,说明缺氧早期促进骨髓来源小鼠巨噬细胞增殖。2. 巨噬细胞敲低KLF5可以延缓心肌细胞衰老和凋亡CCK-8结果显示,无论在常氧还是缺氧环境中,巨噬细胞敲低KLF5都会显著增强心肌细胞的细胞活力。β-半乳糖苷酶染色显示,巨噬细胞敲低KLF5可以减缓心肌细胞的衰老和凋亡。与上述结果吻合,鬼笔环肽结果显示巨噬细胞敲低KLF5能稳定心肌细胞肌丝的束状均匀分布,抑制心肌细胞骨架的解聚。这些结果都表明巨噬细胞敲低KLF5可以延缓心肌细胞的衰老和凋亡。3. 巨噬细胞敲低KLF5抑制心肌细胞衰老和凋亡标志基因表达Western Blot显示,KLF5小鼠巨噬细胞KLF5敲低较为成功。进一步检测心肌细胞衰老和凋亡相关蛋白的表达发现,不论在缺氧还是常氧的环境中,巨噬细胞敲低KLF5抑制心肌细胞中P16的蛋白表达。而P21的蛋白表达在缺氧时与P16一致,但在常氧时其蛋白表达却是上调。RT-PCR显示,在心肌细胞中P16、Caspase3和P21在巨噬细胞敲低KLF5时显著降低。4.巨噬细胞过表达KLF5促进心肌细胞衰老和凋亡Western Blot显示巨噬细胞中KLF5蛋白过表达明显,说明过表达成功。CCK-8结果显示,在缺氧的情况下,巨噬细胞过表达KLF5抑制心肌细胞的细胞活力。β-半乳糖苷酶结果显示,巨噬细胞过表达KLF5能加速心肌细胞的衰老。鬼笔环肽结果显示,巨噬细胞过表达KLF5能破坏心肌细胞的细胞骨架束状分布。Western Blot结果显示巨噬细胞过表达KLF5、P16、Caspase3和P21蛋白的表达量明显增加,RT-PCR结果显示巨噬细胞过表达KLF5时P21、Caspase3表达明显上调。以上结果说明巨噬细胞过表达KLF5促进心肌细胞的衰老和凋亡与上调P16、P21和Caspase3蛋白有关。***参与巨噬细胞和心肌细胞的相互作用RT-PCR结果显示,巨噬细胞敲低KLF5时,心肌细胞circ-KHK、circ-HIF1α、circ-FOXO1表达显著下降,而circ-dnmt3a显著升高。相反在巨噬细胞过表达KLF5时,心肌细胞circ-KHK、circ-HIF1a、circ-FOXO1、circ-dnmt3a这四种circRNA显著降低,提示巨噬细胞KLF5

关键词： KLF5 CircRNA 心肌细胞衰老巨噬细胞

睾酮通过mIGF-1/SIRT1通路延缓心肌细胞衰老的研究

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睾酮通过mIGF-1/SIRT1通路延缓心肌细胞衰老的研究

作者：余星广东药科大学

学位级别：硕士

目的采用百草枯建立HL-1心肌细胞衰老模型,观察睾酮对心肌细胞衰老的影响,并探讨局部作用的胰岛素样生长因子1(Locally acting Insulin‐like Growth Factor-1 isoform,mIGF-1)/沉默信息调节因子2相关酶1(Silent mating type Information Regulation 2 homolog1,SIRT1)通路在睾酮对心肌细胞衰老影响过程中的作用。方法(1)预实验确定百草枯对心肌细胞衰老影响的最佳作用时间、筛选睾酮干预的最佳浓度。通过β-半乳糖苷酶染色法测定细胞衰老率、流式法测定细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平进行细胞衰老检测。(2)观察睾酮对mIGF-1、SIRT1蛋白表达的影响:采用Western blotting法检测正常细胞(CK)组、百草枯诱导(PQ)组、百草枯+睾酮干预(Tes)组mIGF-1、SIRT1的表达水平,采用细胞免疫荧光染色法检测SIRT1在细胞核中的定位。(3)探究mIGF-1在睾酮延缓心肌细胞衰老中的作用及其与SIRT1表达的相关性:预先构建mIGF-1过表达载体及沉默载体并转染心肌细胞,经百草枯+睾酮处理后,分为以下5组:mIGF-1过表达转染(OE-m IGF-1)组、空载转染(NC)组、mIGF-1干扰转染(sh-mIGF-1)组、阴性对照转染(sh-NC)组、空白对照(Tes)组,观察mIGF-1对睾酮处理的心肌细胞衰老效应变化的影响及干扰mIGF-1对SIRT1表达的影响。(4)进一步确定SIRT1在睾酮延缓心肌细胞衰老中的作用:预先构建SIRT1过表达载体及沉默载体并转染心肌细胞,经百草枯+睾酮处理后,分为以下5组:SIRT1过表达转染(OE-SIRT1)组、空载转染(NC)组、SIRT1干扰转染(sh-SIRT1)组、阴性对照转染(sh-NC)组、空白对照(Tes)组,观察SIRT1对睾酮处理的心肌细胞衰老效应变化的影响。(5)qPCR法检测各组细胞收缩/舒张相关酶及蛋白表达变化,进一步观察睾酮、mIGF-1/SIRT1通路激活对衰老心肌细胞伴随的功能影响。结果(1)与CK组相比,100μmol/L百草枯使心肌细胞衰老率增加,以作用时间为72h时差异具有统计学意义(P细胞衰老率及细胞内的ROS水平,以1.0μM浓度时差异最为显著(P﹤0.001)。(2)与PQ组相比,Tes组能增加m IGF-1和SIRT1蛋白表达(P﹤0.01)及SIRT1在细胞核中的定位水平(P﹤0.05)。(3)与Tes组相比,OE-mIGF-1组mIGF-1、SIRT1蛋白表达及SIRT1在细胞核中的定位水平增加(分别为P﹤0.05、P﹤0.01、P﹤0.05),细胞衰老率、ROS水平降低(P﹤0.05)。与Tes组相比,sh-mIGF-1组可下调mIGF-1、SIRT1蛋白表达及SIRT1在细胞核中的定位水平,增加细胞衰老率和ROS水平(P﹤0.05)。与Tes组相比,sh-NC组、NC组上述指标均无统计学差异(P>0.05)。(4)与Tes组相比,OE-SIRT1组SIRT1蛋白表达及SIRT1在细胞核中的定位水平增加(分别为P﹤0.05、P﹤0.01),细胞衰老率、ROS水平降低(P﹤0.05)。与Tes组相比,sh-SIRT1组可下调SIRT1蛋白表达及SIRT1在核中的定位水平,增加细胞衰老率与ROS水平(P﹤0.01)。与Tes组相比,sh-NC组、NC组上述指标均无统计学差异(P>0.05)。(5)与CK组相比,PQ组心肌细胞MYH-7及ACTA-1 mRNAs表达水平增加,MYH-6及SERCA-2 mRNAs表达水平降低(P﹤0.01)。与PQ组相比,Tes组心肌细胞MYH-7及ACTA-1 mRNAs表达降低,MYH-6及SERCA-2 mRNAs表达增加(分别为P﹤0.01、P﹤0.001、P﹤0.01、P﹤0.01)。与Tes组相比,sh-mIGF-1、sh-SIRT1组MYH-7及ACTA-1 mRNAs表达水平升高,MYH-6及SERCA-2 mRNAs表达下降(P﹤0.05);双敲低时(sh-double组,即sh-“mIGF-1 and SIRT1”)呈现出相同趋势,MYH-7及ACTA-1 mRNAs表达水平升高(分别为P﹤0.01、P﹤0.05),MYH-6及SERCA-2 mRNAs表达下降(分别为P﹤0.01、P﹤0.05)。与Tes组相比,OE-mIGF-1组MYH-6 mRNA水平升高(P﹤0.05),OE-SIRT1组MYH-6 mRNA和SERCA-2 mRNA水平升高(分别为P﹤0.05

关键词：睾酮百草枯心肌细胞衰老胰岛素样生长因子1 sirtuin1

基于lncRNA和mRNA表达谱分析探讨LBQ657延缓心肌细胞衰老的分子机制

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基于lncRNA和mRNA表达谱分析探讨LBQ657延缓心肌细胞衰老的分子机...

作者：王智坚广东药科大学

学位级别：硕士

研究背景及目的衰老可导致机体各组织器官的功能下降。衰老在心脏的重要表现形式之一是心力衰竭,而心肌细胞的衰老与心衰的发生发展密切相关。我们既往的研究也显示外源性睾酮治疗可延缓老年雄性小鼠心肌细胞衰老,改善心衰相关的基因表... 详细信息

研究背景及目的衰老可导致机体各组织器官的功能下降。衰老在心脏的重要表现形式之一是心力衰竭,而心肌细胞的衰老与心衰的发生发展密切相关。我们既往的研究也显示外源性睾酮治疗可延缓老年雄性小鼠心肌细胞衰老,改善心衰相关的基因表达异常。沙库巴曲缬沙坦（LCZ696）是由血管紧张素受体阻滞剂缬沙坦和脑啡肽酶抑制剂沙库巴曲构成的共晶体,通过拮抗血管紧张素受体和增强利钠肽功能发挥降压、利钠、扩血管、器官保护等作用,已有充分的临床研究证实其对心衰的治疗具有确切疗效,目前已被多国指南推荐用于心力衰竭的一线治疗。沙库巴曲在体内的主要代谢活性产物为LBQ657。研究证实LBQ657能通过抑制脑啡肽酶的活性而发挥对心血管的保护作用、改善心衰。我们既往研究发现LBQ657在一定程度上可改善心肌细胞衰老状态,在此过程中观察到存在SIRT1、p53等影响细胞代谢、凋亡的因子的变化,但对其机制的研究目前仍很有限。长链非编码RNA（lnc RNA）可通过调控信使RNA（m RNA）,进一步调控其下游蛋白的翻译过程。lnc RNA及m RNA表达谱的测定有利于对相关机制的进一步研究。本研究拟采用D-半乳糖诱导处理小鼠HL-1心肌细胞建立衰老细胞模型,用LBQ657对衰老模型进行干预,并采用高通量测序技术,通过检测各组的HL-1心肌细胞lnc RNA及m RNA表达谱的情况,并构建lnc RNA-m RNA共表达网络,从而探究LBQ657对HL-1心肌细胞衰老的影响及可能作用的机制。方法（1）小鼠HL-1心肌细胞:完全培养基培养。（2）实验分组:（1）对照组（N组）:HL-1心肌细胞,正常培养;（2）衰老模型组（A组）:D-半乳糖处理诱导衰老;（3）LBQ657处理组（L组）:D-半乳糖诱导衰老同时给予LBQ657处理。（3）通过β-半乳糖苷酶染色法,评估三组心肌细胞的衰老率情况。（4）通过检测SOD（超氧化物歧化酶）及MDA（丙二醛）水平,了解心肌细胞抗氧化应激能力的变化。（5）通过q PCR检测MYH-7（肌球蛋白重链7）、ACTA-1（α-肌动蛋白-1）、MYH-6（肌球蛋白重链6）及SERCA-2(肌浆网/内质网Ca-ATP酶-2)的水平,了解心肌细胞衰老及功能障碍相关酶及蛋白表达的影响。（6）通过高通量测序,以检测组间差异表达lnc RNAs及m RNAs。（7）差异m RNA功能（GO、KEGG）富集分析。（8）lnc RNA-m RNA共表达网络的构建。结果（1）衰老模型组与对照组相比心肌细胞衰老率升高,差异具有统计学意义（P衰老模型组相比心肌细胞衰老率下降,差异具有统计学意义（P衰老模型组心肌细胞SOD水平明显降低,MDA水平明显升高,差异具有统计学意义（P衰老模型组相比,LBQ657处理组心肌细胞SOD水平升高,MDA水平降低,差异具有统计学意义（分别为P衰老模型组MYH-6、SERCA-2的表达水平明显减低,而MYH-7、ACTA-1的表达水平明显升高（P衰老模型组相比,LBQ657处理组MYH-6、SERCA-2的表达水平升高,而MYH-7、ACTA-1的表达水平明显下降（P衰老模型组有1294个差异表达的lnc RNAs,其中716个上调,578个下调;有7491个差异表达的m RNAs,其中4885个上调,2606个下调。与衰老模型组相比,LBQ657干预组有811个差异表达的lnc RNAs,其中393个上调,418个下调;有2950个差异表达的m RNAs,其中1556个上调,1394个下调。（5）与对照组比较,衰老模型组显著富集的GO功能主要和代谢过程、细胞凋亡、细胞增殖调节等相关;显著富集的KEGG通路主要和细胞周期、p53信号通路、细胞凋亡等相关。与衰老模型组相比,LBQ657处理组显著富集的GO功能主要和大分子代谢过程的调节、内源性凋亡信号通路、细胞增殖调节等相关;显著富集的KEGG通路主要和细胞凋亡、PPAR信号通路、p53信号通路等相关。（6）聚类热图分析和lnc RNA-m RNA共表达网络分析显示,与对照组相比,衰老模型组心肌细胞Cdkn1b、Bbc3基因表达显著上调（P衰老模型组比较,LBQ657处理组心肌细胞Cdkn1b、Bbc3基因表达显著下调（P心肌细胞衰老具有延缓作用。（2）LBQ657延缓心肌细胞衰老的机制可能存在包括Cdkn1b、Bbc3在内的m RNA

关键词： LBQ657 心肌细胞衰老 Cdkn1b Bbc3 RNA-seq

BRD4/DDAH2调控高糖诱导心肌细胞衰老及作用机制研究

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BRD4/DDAH2调控高糖诱导心肌细胞衰老及作用机制研究

作者：贺双意中南大学

学位级别：硕士

研究背景糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)是独立于冠心病、高血压心脏病、心脏瓣膜病或其他心肌病变的心脏疾病。心肌细胞为心脏主要功能细胞,其数量及活力异常是导致DCM心脏功能障碍的主要原因。衰老是年龄相关的心血管疾... 详细信息

研究背景糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)是独立于冠心病、高血压心脏病、心脏瓣膜病或其他心肌病变的心脏疾病。心肌细胞为心脏主要功能细胞,其数量及活力异常是导致DCM心脏功能障碍的主要原因。衰老是年龄相关的心血管疾病如糖尿病、高血压等的最大危险因素。高糖、高脂和氧化应激等因素可诱导心肌细胞发生应激性衰老。与复制性衰老相比,心肌细胞应激性衰老虽不依赖于端粒的缩短和细胞的增殖停滞,但同样具有衰老表型特点,表现为心肌细胞功能下降,使心脏中能够正常发挥功能的心肌细胞数目下降,影响心脏功能。二甲基精氨酸二甲胺水解酶(Dimethylarginine dimethylaminohydrolases,DDAH)是水解非对称性二甲基精氨酸(Asymmetric dimethylarginine,ADMA)的关键酶,具有DDAH1和DDAH2两种亚型,其中DDAH2在心脏和血管中高表达。研究显示,在多种衰老组织或细胞中DDAH2水平与年轻样本相比存在差异,提示DDAH2/ADMA可能参与心肌细胞衰老。溴结构域蛋白4(bromodomain-containing protein 4,BRD4)是溴结构域和超末端结构蛋白(bromodomain and extra-terminal,BET)家族成员之一。我们通过h TFtarget数据库发现BRD4是调控DDAH2的转录因子。既往研究已证明BRD4与胰岛细胞、巨噬细胞等细胞的衰老发生具有极其密切的联系。基于上述分析和研究,我们推测高糖下,BRD4可能通过抑制DDAH2转录,调控ADMA水平,从而介导高糖诱导的心肌细胞衰老。研究方法细胞实验:分离、培养和鉴定原代心肌细胞。实验分为三部分:(1)高糖(33 m M)处理原代心肌细胞(1,3,5和7天);(2)DDAH2si RNA转染原代心肌细胞12 h后,高糖处理5天;(3)高糖处理3天后,BRD4抑制剂JQ1(0.25、0.5和1μM)与高糖共处理原代心肌细胞48 h。β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老;Western blot检测衰老相关蛋白p53、p21和p16表达;细胞免疫荧光和q RT-PCR检测BRD4和DDAH2表达;ELISA检测ADMA水平;CHIP-q RT-PCR检测BRD4与DDAH2启动子序列结合。动物实验:单次腹腔注射(60 mg/kg)STZ构建糖尿病大鼠模型。检测大鼠体重和血糖水平;小动物超声检测大鼠心脏功能;Western blot检测大鼠心肌组织衰老相关蛋白(p53、p21和p16)、BRD4及DDAH2蛋白水平;q RT-PCR检测大鼠心肌组织BRD4和DDAH2的m RNA水平。实验结果细胞实验:(1)与正常对照组相比,高糖组可时间依赖性地增加β-半乳糖苷酶阳性细胞率,第5天达到显著差异,第7天达高峰;高糖亦可显著增加衰老相关蛋白p53、p21和p16表达上调,表明高糖可诱导心肌细胞衰老发生;(2)高糖可上调BRD4表达,下调DDAH2表达,增加细胞上清液ADMA水平;转染DDAH2 si RNA可上调β-半乳糖苷酶活性和衰老相关蛋白p53、p21和p16表达,表明抑制DDAH2可以模拟高糖诱导心肌细胞衰老;(3)BRD4抑制剂JQ1可逆转高糖引起的衰老性变化,上调DDAH2表达,抑制BRD4表达及减少ADMA水平;(4)CHIP-q RT-PCR证明BRD4可以与DDAH2启动子序列结合,影响DDAH2转录。动物实验:(1)与正常对照组大鼠相比,糖尿病组大鼠出现多饮、多食、多尿症状,且体重降低,血糖升高,表明糖尿病模型建立成功;(2)超声心动图显示,与正常对照组大鼠相比,糖尿病组大鼠舒张末期左室内径(Left ventricular internal dimension at end-diastolic,LVIDd)、收缩末期左室内径(Left ventricular internal dimension at end-systolic,LVIDs)增大;左室射血分数(Left ventricular ejection fraction,LVEF)及短缩率(Fractional shortening,FS)显著下降,Tei指数升高,表明糖尿病大鼠左心室舒张和收缩功能受损;(3)与正常对照组大鼠相比,糖尿病组大鼠心肌组织衰老相关蛋白p53、p21和p16表达增加;(4)与正常对照组大鼠相比,糖尿病组大鼠心肌组织BRD4表达上调,DDAH2表达下调。实验结论(1)高糖可诱导心肌细胞衰老。(2)DDAH2/ADMA介导了高糖诱导的心肌细胞衰老。(3)BRD4可通过调控DDAH2/ADMA通路介导高糖诱导的心肌细胞衰老。图13幅,表6个,参考文献51篇

关键词：心肌细胞衰老糖尿病二甲基精氨酸二甲胺水解酶溴结构域蛋白4

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心肌肥大成人心脏组织动力学观察

郑州大学学报（医学版） 2007年第2期42卷 212-214页

作者：史学义王红梅王峰邢文英吴景兰乐晓萍郑州大学基础医学院组织学与胚胎学教研室郑州450052

目的:观察心肌肥大成人心脏组织动力学特点。方法:4例心肌肥大患者尸检心脏组织标本常规石蜡切片,HE染色,光学显微镜观察。结果:心肌肥大心脏心肌细胞可见无丝分裂相,细胞核纵裂所占比例比正常心脏增加,细胞死亡征象明显,心肌层内血管... 详细信息

目的:观察心肌肥大成人心脏组织动力学特点。方法:4例心肌肥大患者尸检心脏组织标本常规石蜡切片,HE染色,光学显微镜观察。结果:心肌肥大心脏心肌细胞可见无丝分裂相,细胞核纵裂所占比例比正常心脏增加,细胞死亡征象明显,心肌层内血管形成受阻。结论:心肌肥大心脏组织动力学的基本特征是由于血源性生心肌干细胞来源不足,导致心肌老龄化。

关键词：心肌肥大心肌细胞衰老脂褐质人