BRD4/DDAH2调控高糖诱导心肌细胞衰老及作用机制研究

作     者：贺双意 

作者单位：中南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：江俊麟

授予年度：2023年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：心肌细胞衰老 糖尿病 二甲基精氨酸二甲胺水解酶 溴结构域蛋白4 

摘      要：研究背景糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)是独立于冠心病、高血压心脏病、心脏瓣膜病或其他心肌病变的心脏疾病。心肌细胞为心脏主要功能细胞,其数量及活力异常是导致DCM心脏功能障碍的主要原因。衰老是年龄相关的心血管疾病如糖尿病、高血压等的最大危险因素。高糖、高脂和氧化应激等因素可诱导心肌细胞发生应激性衰老。与复制性衰老相比,心肌细胞应激性衰老虽不依赖于端粒的缩短和细胞的增殖停滞,但同样具有衰老表型特点,表现为心肌细胞功能下降,使心脏中能够正常发挥功能的心肌细胞数目下降,影响心脏功能。二甲基精氨酸二甲胺水解酶(Dimethylarginine dimethylaminohydrolases,DDAH)是水解非对称性二甲基精氨酸(Asymmetric dimethylarginine,ADMA)的关键酶,具有DDAH1和DDAH2两种亚型,其中DDAH2在心脏和血管中高表达。研究显示,在多种衰老组织或细胞中DDAH2水平与年轻样本相比存在差异,提示DDAH2/ADMA可能参与心肌细胞衰老。溴结构域蛋白4(bromodomain-containing protein 4,BRD4)是溴结构域和超末端结构蛋白(bromodomain and extra-terminal,BET)家族成员之一。我们通过h TFtarget数据库发现BRD4是调控DDAH2的转录因子。既往研究已证明BRD4与胰岛细胞、巨噬细胞等细胞的衰老发生具有极其密切的联系。基于上述分析和研究,我们推测高糖下,BRD4可能通过抑制DDAH2转录,调控ADMA水平,从而介导高糖诱导的心肌细胞衰老。研究方法细胞实验:分离、培养和鉴定原代心肌细胞。实验分为三部分:(1)高糖(33 m M)处理原代心肌细胞(1,3,5和7天);(2)DDAH2si RNA转染原代心肌细胞12 h后,高糖处理5天;(3)高糖处理3天后,BRD4抑制剂JQ1(0.25、0.5和1μM)与高糖共处理原代心肌细胞48 h。β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老;Western blot检测衰老相关蛋白p53、p21和p16表达;细胞免疫荧光和q RT-PCR检测BRD4和DDAH2表达;ELISA检测ADMA水平;CHIP-q RT-PCR检测BRD4与DDAH2启动子序列结合。动物实验:单次腹腔注射(60 mg/kg)STZ构建糖尿病大鼠模型。检测大鼠体重和血糖水平;小动物超声检测大鼠心脏功能;Western blot检测大鼠心肌组织衰老相关蛋白(p53、p21和p16)、BRD4及DDAH2蛋白水平;q RT-PCR检测大鼠心肌组织BRD4和DDAH2的m RNA水平。实验结果细胞实验:(1)与正常对照组相比,高糖组可时间依赖性地增加β-半乳糖苷酶阳性细胞率,第5天达到显著差异,第7天达高峰;高糖亦可显著增加衰老相关蛋白p53、p21和p16表达上调,表明高糖可诱导心肌细胞衰老发生;(2)高糖可上调BRD4表达,下调DDAH2表达,增加细胞上清液ADMA水平;转染DDAH2 si RNA可上调β-半乳糖苷酶活性和衰老相关蛋白p53、p21和p16表达,表明抑制DDAH2可以模拟高糖诱导心肌细胞衰老;(3)BRD4抑制剂JQ1可逆转高糖引起的衰老性变化,上调DDAH2表达,抑制BRD4表达及减少ADMA水平;(4)CHIP-q RT-PCR证明BRD4可以与DDAH2启动子序列结合,影响DDAH2转录。动物实验:(1)与正常对照组大鼠相比,糖尿病组大鼠出现多饮、多食、多尿症状,且体重降低,血糖升高,表明糖尿病模型建立成功;(2)超声心动图显示,与正常对照组大鼠相比,糖尿病组大鼠舒张末期左室内径(Left ventricular internal dimension at end-diastolic,LVIDd)、收缩末期左室内径(Left ventricular internal dimension at end-systolic,LVIDs)增大;左室射血分数(Left ventricular ejection fraction,LVEF)及短缩率(Fractional shortening,FS)显著下降,Tei指数升高,表明糖尿病大鼠左心室舒张和收缩功能受损;(3)与正常对照组大鼠相比,糖尿病组大鼠心肌组织衰老相关蛋白p53、p21和p16表达增加;(4)与正常对照组大鼠相比,糖尿病组大鼠心肌组织BRD4表达上调,DDAH2表达下调。实验结论(1)高糖可诱导心肌细胞衰老。(2)DDAH2/ADMA介导了高糖诱导的心肌细胞衰老。(3)BRD4可通过调控DDAH2/ADMA通路介导高糖诱导的心肌细胞衰老。图13幅,表6个,参考文献51篇