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线粒体靶向多肽SS-31在弗里德赖希共济失调疾病治疗中的应用价值

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线粒体靶向多肽SS-31在弗里德赖希共济失调疾病治疗中的应用价值

作者：赵洪婷南京大学

学位级别：硕士

研究背景:弗里德赖希共济失调(Friedreich ataxia,FRDA)是一种常染色体隐性遗传的神经退行性疾病。该病的发病年龄常在儿童早期,病程呈进程性发展,多在40到50岁死亡。FRDA病人的主要临床症状表现为脊柱侧弯、中枢神经系统衰退、深感觉... 详细信息

研究背景:弗里德赖希共济失调(Friedreich ataxia,FRDA)是一种常染色体隐性遗传的神经退行性疾病。该病的发病年龄常在儿童早期,病程呈进程性发展,多在40到50岁死亡。FRDA病人的主要临床症状表现为脊柱侧弯、中枢神经系统衰退、深感觉丧失、肌肉虚弱无力和心肌肥大。FRDA的主要发病机制是人类第9号染色体上frataxin(FXN)基因的第一个内含子中存在GAA序列的大量重复扩增,导致FXN蛋白表达减少。而FXN蛋白是参与铁硫簇合成的重要分子,线粒体中许多酶需要铁硫簇作为辅基发挥活性。因此,FXN蛋白表达减少将会影响细胞内铁硫簇的合成和铁稳态,进而引起线粒体功能障碍和氧化应激的发生,最终导致FRDA的发生。目前为止,尚未发现有效治疗FRDA疾病的药物,一些旨在改善线粒体功能和提高FXN表达的治疗方法仍在探究中。SS-31是Szeto和Schiller研究发现的一类线粒体靶向的化合物,具有很好的抗氧化作用。SS-31能够靶向聚集在线粒体内膜上,促进电子传递,增加ATP的合成,并减少活性氧(ROS)的产生。研究表明,SS-31在线粒体功能失调和氧化应激的疾病模型中具有很好的保护作用。目的:在本研究中我们以FRDA病人来源的淋巴细胞系GM15850为研究对象,以正常人淋巴细胞系GM15849,GM14519作为对照,旨在研究SS-31是否能够改善病人细胞线粒体的功能及其作用机制,进而明确其是否具有治疗FRDA的潜在应用价值。具体研究内容主要有:(1)明确SS-31对FXN表达的影响。(2)检测线粒体功能指标,明确SS-31是否能够改善病人细胞线粒体的功能。(3)检测含有铁硫簇的酶的活性,研究SS-31对病人细胞铁硫簇合成的影响。(4)检测病人细胞中铁代谢相关蛋白的表达,研究SS-31对病人细胞铁代谢的影响。(5)研究SS-31对病人细胞ROS的水平及清除和抵抗ROS能力的影响。(6)检测SS-31对FXN转录和翻译水平的影响,确定SS-31上调FXN表达的机制。方法:1)用不同浓度SS-31处理FRDA病人淋巴细胞,通过Western blotting检测Frataxin的蛋白水平,筛选出合适的用药浓度和处理时间。2)测定SS-31处理后的病人细胞中MMP,ATP,NADH/NAD+及线粒体拷贝数,电镜下观察线粒体形态。3)测定SS-31处理后的病人细胞中顺乌头酸酶,电子传递链,黄嘌呤氧化酶的活性。4)Western blotting检测健康人细胞,FRDA病人细胞以及SS-31处理后的病人细胞中铁调节蛋白2(IRP2),转铁蛋白受体1(TfR1)和铁蛋白(ferritin)的表达,用荧光探针检测细胞中可利用的铁水平。5)流式细胞术检测健康人、病人细胞及SS-31处理后的病人细胞中ROS的水平,超氧化物歧化酶,过氧化氢酶活性和蛋白水平,以及用CCK8检测细胞对过氧化氢的抵抗能力。6)实时定量PCR检测FXN的mRNA水平,SILAC检测新合成的FXN的水平。结果:(1)SS-31处理提高了 FXN的表达水平。(2)SS-31处理改善了病人细胞的线粒体膜电位,提高了 ATP的含量,并且使病人细胞NADH/NAD+比值下降,保护了线粒体内膜结构,说明SS-31改善了病人细胞线粒体的质量。荧光定量PCR结果显示SS-31增加了病人细胞中线粒体的数目。(3)SS-31处理提高了病人细胞中线粒体顺乌头酸酶,电子传递链复合物Ⅱ,Ⅲ的活性,对黄嘌呤氧化酶XOD的活性没有影响。(4)SS-31处理提高了病人细胞中IRP2,TfR1和ferritin的蛋白水平,增加了病人细胞线粒体中可利用的铁水平。(5)病人细胞中ROS水平明显高于正常人细胞,SS-31处理减少了病人细胞中ROS含量,增强病人细胞抵抗氧化应激的能力。(6)SS-31对FXN的mRNA水平没有影响,显著增加了新合成的FXN,从翻译水平上调FXN的表达。结论:SS-31在翻译水平上调了 FXN的表达,改善了 FRDA病人细胞的线粒体功能,增强FRDA病人细胞抗氧化应激能力;SS-31有望成为治疗FRDA的潜在药物。

关键词：弗里德赖希共济失调 frataxin SS-31 线粒体功能转录水平

弗里德赖希共济失调YG8R转基因小鼠的运动行为学及病理变化比较

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中风与神经疾病杂志 2023年第4期40卷 327-331页

作者：张晓静林培彬欧文倩广州医科大学附属第六医院清远市人民医院药学部广东清远511518

目的比较弗里德赖希共济失调(FRDA)转基因(YG8R)小鼠运动行为学及病理变化。方法利用加速转棒实验、旷场实验、抓力实验和步态检测等行为学手段,评价YG8R转基因小鼠与同窝野生型(WT)小鼠的运动差异;免疫组化染色评价小鼠脊髓组织中神经... 详细信息

目的比较弗里德赖希共济失调(FRDA)转基因(YG8R)小鼠运动行为学及病理变化。方法利用加速转棒实验、旷场实验、抓力实验和步态检测等行为学手段,评价YG8R转基因小鼠与同窝野生型(WT)小鼠的运动差异;免疫组化染色评价小鼠脊髓组织中神经元的死亡情况;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测小鼠背根神经节(DRG)和小脑组织中Frataxin mRNA的表达水平。结果从第4个月开始,与WT组相比,YG8R小鼠的在棒时间、运动距离和抓力均明显下降(P<0.05);在第6个月,与WT组相比,YG8R小鼠的左后肢和右后肢步长距离显著下降(P<0.05),YG8R小鼠两前肢和两后肢步宽显著增加(P<0.01),右后肢的摆动时间显著下降(P<0.01),左后肢及右后肢触地时间显著增加(P<0.05);YG8R小鼠脊髓中神经元数量显著降低(P<0.01);qRT-PCR结果表明,与WT组相比,YG8R小鼠脊髓和DRG中Frataxin mRNA水平均显著降低(P<0.0001)。结论本研究进一步提供了基于GAA重复扩增的转基因YG8R小鼠FRDA模型的详细运动特征及病理变化,这将为后续研究FRDA的疾病机制和治疗提供证据。

关键词：弗里德赖希共济失调 YG8R小鼠运动行为学 Frataxin

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弗里德赖希氏共济失调病人神经元丢失的机制研究

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弗里德赖希氏共济失调病人神经元丢失的机制研究

作者：孙晓艳南京大学

学位级别：硕士

研究背景：弗里德赖希氏共济失调(Friedreich ataxia, FRDA)是编码frataxin蛋白的FXN基因突变引起的遗传性神经退行性疾病,其临床症状表现为外周和中枢神经系统的退行性病变,并伴有肥大型心脏病和糖尿病。Frataxin蛋白是线粒体内重要的... 详细信息

研究背景：弗里德赖希氏共济失调(Friedreich ataxia, FRDA)是编码frataxin蛋白的FXN基因突变引起的遗传性神经退行性疾病,其临床症状表现为外周和中枢神经系统的退行性病变,并伴有肥大型心脏病和糖尿病。Frataxin蛋白是线粒体内重要的铁伴侣分子,与铁硫簇的合成相关,铁硫簇参与细胞内多种酶的合成及活化。frataxin蛋白表达量减少使细胞线粒体内铁积累,引起氧化应激和线粒体功能障碍,最终引起FRDA病人神经元细胞的死亡。Frataxin缺失引起的这一系列变化与新发现的一种死亡方式ferroptosis很相似。Ferroptosis是由铁依赖性的氧化损伤引起的细胞死亡模式,不同于凋亡、自噬、坏死。且低氧诱导因子HIF的表达与氧气和铁相关,所以我们推测frataxin缺失后导致神经元细胞发生ferroptosis,且影响HIF的表达,最终导致FRDA疾病的发生。硫辛酸(a-LA)作为一种抗氧化剂和抗氧化剂的保护剂,可以保护细胞抵抗氧化应激,即保护细胞抵抗ferroptosis,进而起到保护细胞的作用。目的： (1)研究frataxin缺失引起细胞死亡与ferroptosis发生的关系;(2)检测硫辛酸能否保护细胞抵抗erastin诱导的ferroptosis;(3)研究FXN与HIF的表达调控间的关系。方法：(1)本文中通过测定顺乌头酸酶活性,来研究frataxin缺失的FRDA病人淋巴细胞内铁硫簇的合成情况;(2)用Western blot检测FRDA病人淋巴细胞中IRP1、IRP2、Ft、HIF1α的表达情况以及去铁剂(DFO、DFP)处理后健康人细胞中IRP1、IRP2、Ft、HIF1α的表达情况;(3)用Perl DAB进行铁染色,观察frataxin缺失的FRDA病人细胞内铁的含量;(4)用不同浓度的erastin、Fer-1、DFO处理健康人B淋巴细胞(GM15849),显微观察细胞的形态,筛选合适的erastin浓度;(5)用不同浓度的谷氨酸钠处理SH-SY5Y细胞,通过CCK-8检测细胞生存能力,筛选合适的谷氨酸钠浓度;(6)用不同浓度的α-LA处理SH-SY5Y细胞后,再加入谷氨酸钠,用CCK-8检测细胞生存能力的变化;(7)用α-LA处理神经瘤母细胞SH-SY5Y后,再加入erastin,显微观察细胞的形态和生长状态;(8)用QPCR的方法检测frataxin的缺失对HIF下游靶蛋白表达的影响。结果：(1)FRDA病人淋巴细胞中aconitase的活性降低;IRP1、IRP2的表达明显上调,ferritin表达下调;(2)Erastin可诱导健康人和FRDA病人细胞发生ferroptosis,但是健康人细胞对erastin更敏感;Fer-1和DFO可以保护健康人细胞抵抗erastin的毒性,FAC加剧了erastin引起的细胞毒性;Fer-1可以保护FRDA病人细胞抵抗erastin的毒性,但是DFO和FAC都加剧了erastin引起的细胞毒性;(3)α-LA可以保护细胞抵抗谷氨酸钠和erastin诱导的细胞毒性;(4)FRDA病人细胞中HIF1α的蛋白水平上调,同时,HIF1α及其下游靶基因对低氧的应答改变。结论：Ferroptosis可能不是frataxin的缺失导致FRDA神经元丢失的机制;硫辛酸可对由erastin诱导的ferrroptosis起到保护作用;Frataxin的缺失诱导细胞处于对低氧的应答反应中,但是丢失了真正需要对低氧产生应答的能力。

关键词：弗里德赖希共济失调 Frataxin Ferroptosis 低氧诱导因子

评价弗里德赖希共济失调症病人的脑白质纤维束萎缩

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国际医学放射学杂志 2010年第4期 387-387页

作者： E.Pagani A.Ginestroni R.D.Nave F.Agosta F.Salvi G.D.Michele 郭丽君 Neuroimaging Research Unit Institute of Experimental NeurologyDivision of NeuroscienceScientific Institute and University Hospital San RaffaeleVia Olgettina 6020132 MilanItaly

目的弗里德赖希共济失调症是以脑白质不均匀受累为特征的一种病理状态,活体研究该病病人脑白质(WM)纤维束萎缩的图形分布及严重程度,并将所得出结果与病人临床症状进行

关键词：白质纤维束脑白质 WM 弗里德赖希共济失调病人

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遗传性共济失调诊断与治疗专家共识

中华神经科杂志 2015年第6期48卷 459-463页

作者：中华医学会神经病学分会神经遗传学组中华医学会神经病学分会神经遗传学组

一、概述遗传性共济失调（hereditaryataxia，HA）是一大类具有高度临床和遗传异质性、病死率和病残率较高的遗传性神经系统退行性疾病，约占神经系统遗传性疾病的10％。15％[1-2]。在欧洲，常染色体显性遗传性小脑性共济失调（ autosom... 详细信息

一、概述遗传性共济失调（hereditaryataxia，HA）是一大类具有高度临床和遗传异质性、病死率和病残率较高的遗传性神经系统退行性疾病，约占神经系统遗传性疾病的10％。15％[1-2]。在欧洲，常染色体显性遗传性小脑性共济失调（ autosomal dominant cerebellar ataxia, ADCA ）的患病率为（1～3）／10万[3]，常染色体隐性遗传小脑性共济失调（autosomal recessive cerebellar ataxia，ARCA）中最常见的弗里德赖希共济失调（Friedreichataxia，FRDA）患病率为（3～4）／10万[4]。HA多于20～40岁发病，但也有婴幼儿及老年发病者，临床上以共济运动障碍为主要特征，可伴有复杂的神经系统损害，如锥体束、锥体外系、大脑皮质、脊髓、脑神经、脊神经、自主神经等症状，亦可伴有非神经系统表现如心脏病变、内分泌代谢异常、骨骼畸形、皮肤病变等。

关键词：遗传性共济失调小脑性共济失调神经系统退行性疾病神经系统遗传性疾病常染色体显性遗传性弗里德赖希共济失调常染色体隐性遗传内分泌代谢异常

Friedreich共济失调的临床特征及GGA三核苷酸重复突变分析

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卒中与神经疾病 2005年第3期12卷 172-174页

作者：许波江泓唐北沙张玉虎汤建光刘小民郭纪峰中南大学湘雅医院神经内科

目的研究弗里赖希共济失调(FRDA)的临床特征和X25基因(GAA)n重复序列突变。方法应用聚合酶链反应(PCR)技术结合琼脂糖凝胶电泳分析,对2个临床诊断为(FRDA)的2例患者及4例家系成员进行X25基因(GAA)n重复序列和FRDA患者的临床特征进行分... 详细信息

目的研究弗里赖希共济失调(FRDA)的临床特征和X25基因(GAA)n重复序列突变。方法应用聚合酶链反应(PCR)技术结合琼脂糖凝胶电泳分析,对2个临床诊断为(FRDA)的2例患者及4例家系成员进行X25基因(GAA)n重复序列和FRDA患者的临床特征进行分析。结果2例患者及4例家系成员均证实PCR产物大小为500bp,均为纯合子,其等位基因片断中(GAA)n重复序列拷贝数为13个,排除了X25基因(GAA)n突变。2例患者主要表现为进行性躯干共济失调,并首次报道伴随癫痢发作。结论FRDA具有一定的临床和遗传异质性,遗传学分析可以明确诊断。

关键词：弗里德赖希共济失调临床特征三核苷酸重复等位基因

艾地苯醌在神经系统疾病治疗中的作用——新认识和新发现

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国际脑血管病杂志 2011年第8期19卷 561-567页

作者：姬仲王胜男潘速跃南方医科大学南方医院神经内科广州510515

艾地苯醌足辅酶Q10的一种合成类似物。作为一种强效抗氧化剂，艾地苯醌能在低氧张力状况下发挥作用，通过抑制脂质过氧化来保护细胞膜和线粒体免受氧化损伤，从而对抗脑缺血和中枢神经系统损伤。艾地苯醌还能与线粒体电子传递链相互作... 详细信息

艾地苯醌足辅酶Q10的一种合成类似物。作为一种强效抗氧化剂，艾地苯醌能在低氧张力状况下发挥作用，通过抑制脂质过氧化来保护细胞膜和线粒体免受氧化损伤，从而对抗脑缺血和中枢神经系统损伤。艾地苯醌还能与线粒体电子传递链相互作用，维持缺血状况下的ATP形成。由于艾地苯醌具有良好的耐受性和安全性，因此有望作为一种神经保护剂用于急性缺血性卒中的治疗。近年来的研究表明，艾地笨醌在各种涉及线粒体功能障碍和氧化应激损伤的神经系统疾病，如线粒体脑肌病、乳酸酸中毒和卒中样发作综合征、弗里德赖希共济失调、阿尔茨海默病、Leber遗传性视神经病变和Duchenne肌营养不良中均具有一定的治疗作用。目前，在线粒体相关疾病和神经肌肉病变中的一些临床试验正在进行之中，其结果有望进一步拓宽艾地苯醌的适应证。

关键词：泛醌艾地苯醌抗氧化药氧化性应激神经保护药脑缺血弗里德赖希共济失调阿尔茨海默病线粒体

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3种转录因子对FXN基因表达的影响

医学研究生学报 2013年第7期26卷 690-694页

作者：戴晓曼周迪李宽钰南京大学医学院南京210093 福建医科大学附属协和医院老年医学研究所

目的弗里德赖希共济失调(Friedreich ataxia,FRDA)是一种常染色体隐性遗传疾病,其发病机制是frataxin(FXN)基因的第1个内含子上GAA序列的大量重复扩展,使FXN蛋白表达量减少所致。文中旨在研究FXN基因启动子区域上的转录因子对FXN表达的... 详细信息

目的弗里德赖希共济失调(Friedreich ataxia,FRDA)是一种常染色体隐性遗传疾病,其发病机制是frataxin(FXN)基因的第1个内含子上GAA序列的大量重复扩展,使FXN蛋白表达量减少所致。文中旨在研究FXN基因启动子区域上的转录因子对FXN表达的影响。方法运用Genomatix软件预测出FXN基因的启动子区域及转录因子可能的结合位点,用基因定点突变技术克隆这些结合位点,并用双报告基因法检测启动子活性;qPCR、Western blot以及酶活性实验分别用于检测过表达转录因子后FXN表达量的变化及FXN在铁代谢中的功能。结果启动子活性测定发现FXN基因的启动子1和启动子2活性较高,在该活性较高区域,预测出转录因子可能结合位点,并发现这些结合位点对启动子的活性很重要;过表达转录因子HMX2、HMX3和EGR3能促进细胞内源性FXN mRNA和蛋白的表达,并影响细胞内铁代谢水平。结论转录因子HMX2,HMX3和EGR3能够促进FXN基因的表达,增强细胞铁代谢的能力和线粒体的功能。

关键词：弗里德赖希共济失调启动子 Frataxin HMX2 HMX3 EGR3

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心肌疾病

国外科技资料目录（医药卫生） 2000年第6期 77-77页

0020972 缺乏或热淋巴细胞的小鼠的病毒性心肌炎的严重性增加/Kanda T∥Int JCardiol.-1999,68（1）.-13～22 津医情0020973 伴有弗里德赖希共济失调的心肌病的明显变异/Dutka D P∥Heart.-1999,81（2）.-141～147 津医情0020974 扩张... 详细信息

0020972 缺乏或热淋巴细胞的小鼠的病毒性心肌炎的严重性增加/Kanda T∥Int JCardiol.-1999,68（1）.-13～22 津医情0020973 伴有弗里德赖希共济失调的心肌病的明显变异/Dutka D P∥Heart.-1999,81（2）.-141～147 津医情0020974 扩张型心肌病[日]/上野光∥临检.-1999,43（4）.-466～471 友谊医0020975 应用123IBMIPP SPECT 评价特发性扩张型心肌病患者心肌脂肪酸代谢异常:临床病理所见与临床病程的相互关系/Yazaki Y∥Heart.-1999,81（2）.-153～159

关键词：扩张型心肌病病毒性心肌炎弗里德赖希共济失调淋巴细胞特发性扩张性心肌病临床病理脂肪酸心肌疾病相互关系