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急性病毒性坏死病毒引物酶表达及酶学活性分析

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水产学报 2013年第9期37卷 1401-1408页

作者：钱璟王崇明潘鲁青黄倢中国海洋大学水产学院海水养殖教育部重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所

根据急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)ORF 024序列设计引物,以AVNV的DNA为模板进行扩增AVNV引物酶(primase)基因,同时构建表达质粒pET32a-prim,并转化至E.coli BL21(DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE检测显示诱导表达两条蛋白条带,其中分子量为60 ku的蛋白条带与预期表达蛋白条带大小一致,另一蛋白条带分子量约为55 ku,经Western-blotting及质谱分析鉴定分子量60 ku的蛋白条带为AVNV-引物酶,而表达出的55 ku蛋白条带存在部分引物酶多肽片段。RNA结合荧光染料Pico-Green在30 min内荧光强度比较稳定,从而确定30 min为进行AVNV引物酶活性分析的最佳终止反应时间,并在引物合成实验中观察到30 min内引物酶活性较高。当使用多聚胞嘧啶寡核苷酸poly(d C)为模板时,重组引物酶能特异性催化底物GTP。0.1 mmol/L Zn2+可显著增强引物酶活性,而1mmol/L Mn2+和EDTA能抑制引物酶活性。

关键词：引物酶原核表达 Pico-Green核酸染料酶学活性多聚胞嘧啶寡核苷酸

急性病毒性坏死病毒引物酶基因克隆、表达及相关功能分析

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急性病毒性坏死病毒引物酶基因克隆、表达及相关功能分析

作者：钱璟中国海洋大学

学位级别：硕士

栉孔扇贝（Chlamysfarreri）是我国北方沿海重要的优良养殖经济贝类之一，其规模化养殖已有30多年，给我国山东半岛和辽东半岛等沿海地区带来了可观的经济效益，1990年以来，我国北方养殖海区连年暴发栉孔扇贝大规模死亡（死亡率在90%... 详细信息

栉孔扇贝（Chlamysfarreri）是我国北方沿海重要的优良养殖经济贝类之一，其规模化养殖已有30多年，给我国山东半岛和辽东半岛等沿海地区带来了可观的经济效益，1990年以来，我国北方养殖海区连年暴发栉孔扇贝大规模死亡（死亡率在90%以上），从而使栉孔扇贝养殖业蒙受巨大的经济损失，严重影响了贝类产业的可持续发展。多年研究发现，引发我国北方养殖海区栉孔扇贝夏季大规模死亡的病原就是急性病毒性坏死病毒（acuteviralnecrosisvirus，AVNV），此病毒是呈球形的双链DNA病毒，它主要分布于扇贝外套膜、消化腺、肠和肾脏间质组织细胞和结缔组织细胞中，任伟成等完成了AVNV全基因组测序，在AVNV全基因组预测的潜在开放阅读框（openreadingframes，ORF）中，发现与AVNV的DNA复制、核酸修饰与代谢及病毒与宿主相互作用相关的ORF有44个。其中ORF024编码的引物酶基因参与病毒DNA复制。引物酶（primase）是一种存在于生物及病毒体内的RNA聚合酶，它与DNA的复制和病毒活性密切相关。为确定ORF024能否编码特定的、具有功能的引物酶，以及编码的引物酶是否在AVNV中感染、复制以及在急性病毒性坏死症（acuteviralnecrosisDisease，AVND）暴发中发挥作用，作者根据AVNV引物酶基因设计特异性引物进行扩增AVNV引物酶ORF024，并构建引物酶基因的原核表达载体，在E.coli中进行原核表达、纯化并对重组引物酶进行酶学活性分析。然后利用绿茶提取物（茶多酚）对AVNV引物酶的抑制作用，来探讨茶多酚抗病毒的作用机理。此外，利用AVNV感染栉孔扇贝，通过相对实时荧光定量PCR分析不同组织在不同时间的引物酶基因表达情况，在mRNA水平上进行转录与时序表达分析，探讨AVNV引物酶基因对AVNV在扇贝体内复制的影响，同时在AVNV病毒提取液中加入茶多酚再进行感染栉孔扇贝，通过实时荧光定量PCR分析不同组织在不同时间的引物酶基因表达，探讨茶多酚对AVNV在扇贝体内复制的抑制及其抑制效率，从而为茶多酚可能的抗AVNV作用机理提供理论依据。 1．AVNV引物酶基因的克隆及原核表达。根据AVNV基因组序列，设计特异性引物，扩增编码AVNV引物酶的ORF024，经1%琼脂糖凝胶电泳得到一条约1050bp大小的条带，双酶切后将其连接至pET32a中构建重组原核表达载体pET32a-prim，并将其转化至感受态细胞BL21（DE3）中，加IPTG至终浓度1mmol/L，诱导4-5小时后，SDS-PAGE电泳得到一条约60KDa的条带，经Western-blotting及质谱分析确定为重组引物酶。 2．重组引物酶的纯化及酶学活性分析。利用Co2+亲和层析柱对表达的重组引物酶进行纯化，并测定纯化的重组引物酶的活性、底物特异性、不同金属离子及EDTA对其活性的影响。结果表明：在以poly（dC）为单链模板时，重组引物酶对随机引物的合成具有一定的催化活性;AVNV引物酶具有较强的底物特异性，能特异性催化GTP水解;Zn2+、Na+、K+和Mg2+这四种金属离子对重组引物酶的催化活性具有促进作用，Zn2+浓度为0.1mmol/L时促进率为5%，Na+浓度为5mmol/L促进率只为3%。而Mn2+对重组引物酶的催化活性具有明显抑制作用;EDTA对重组引物酶的催化活性具有抑制作用，浓度越高，抑制率越强，EDTA浓度为10mmol/L时，抑制率达12.20%。 3．利用在引物合成反应体系中加入不同浓度的茶多酚溶液，探讨茶多酚对体外重组引物酶活性和引物合成的影响，在茶多酚7.81μg/ml、31.25μg/ml和125μg/ml的浓度作用结果如下：引物酶活性抑制率随茶多酚浓度升高而逐渐增加，浓度125μg/ml时的抑制率达15.03%;引物合成的量随茶多酚浓度升高而逐渐增加，浓度125μg/ml时的促进率达11.79%。 4．通过AVNV病毒粗提液和混合茶多酚的病毒粗提液分别感染栉孔扇贝，利用实时荧光定量技术进行引物酶基因的转录时序分析。分别取感染AVNV病毒和感染混合茶多酚的AVNV病毒0，4，8，16，24，36，48和72h后栉孔扇贝的外套膜和鳃，提取总RNA，反转录，荧光定量PCR。结果发现：AVNV引物酶基因在外套膜和鳃中的表达量分别于16和8h达到最大值;茶多酚（7.81μg/ml）对AVNV引物酶的复制存在一定的抑制作用，在外套膜和鳃中的抑制率分别为5倍和10倍。结合本实验结果可以得出以下结论：AVNVORF024编码的引物酶具有催化活性，不同金属离子对引物酶活性影响存在差异，如Zn2+和Na+对引物酶活性存在促进作用，而Mn2+和EDTA对引物酶催在强烈抑制作用。同时引物酶基因是一种早期基因，AVNV病毒引物酶基因在栉孔扇贝外套膜和鳃中的最大表达量和最大表达量的时间存在一定的差异，在外套膜中，引物

关键词：引物酶 AVNV 原核表达酶学活性茶多酚

DNA引物酶的提取分离与引物合成活性的研究

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中山医科大学学报 1997年第4期18卷 279-281页

作者：朱孝峰刘宗潮谢冰芬潘启超冯公侃李奕荪中山医科大学肿瘤研究所治疗基础研究室

以小鼠艾氏腹水癌细胞经超声破碎的提取液为材料，依次用ＤＥ５２和Ｐ１１层析柱进行离子线性洗脱，分别在ＫＣｌ浓度为０．１７～０．２ｍｏｌ／Ｌ和０．２５～０．２７ｍｏｌ／Ｌ处ＤＮＡ引物酶被洗脱下来。用大肠杆菌大片段ＤＮ... 详细信息

以小鼠艾氏腹水癌细胞经超声破碎的提取液为材料，依次用ＤＥ５２和Ｐ１１层析柱进行离子线性洗脱，分别在ＫＣｌ浓度为０．１７～０．２ｍｏｌ／Ｌ和０．２５～０．２７ｍｏｌ／Ｌ处ＤＮＡ引物酶被洗脱下来。用大肠杆菌大片段ＤＮＡ多聚酶Ⅰ延长引物法检测ＤＮＡ引物酶比活性为８７５３Ｕ／ｍｇ，酶总获得为２２．１％。

关键词：引物酶 DNA 引物合成肿瘤增殖基因疗法

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苹果锈果类病毒陕西秦冠分离物的鉴定与序列分析

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植物保护学报 2016年第5期43卷 877-878页

作者：吴宽赵磊孙丽英郝兴安康振生吴云锋西北农林科技大学植物保护学院旱区作物逆境生物学国家重点实验室农业部西北黄土高原作物有害生物综合治理重点实验室植保资源与病虫害治理教育部重点实验室陕西杨凌712100

陕西省是我国苹果种植大省,苹果锈果病的发生严重影响其苹果产业,该病是由苹果锈果类病毒（Apple scar skin viroid,ASSVd）引起的,陈炜和田波（1985）首次在国内发现了ASSVd的RNA,Hashimoto＆Koganezawa（1987）首次报道了ASSVd的全基... 详细信息

陕西省是我国苹果种植大省,苹果锈果病的发生严重影响其苹果产业,该病是由苹果锈果类病毒（Apple scar skin viroid,ASSVd）引起的,陈炜和田波（1985）首次在国内发现了ASSVd的RNA,Hashimoto＆Koganezawa（1987）首次报道了ASSVd的全基因组序列。

关键词：分离物秦冠全基因组序列序列分析 Apple 果类测序技术下游引物引物酶 RNA

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嗜热脂肪芽孢杆菌dnaB-dnaG复合体的结构及调控机制

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生物技术通报 2013年第6期29卷 39-45页

作者：卢汀中国科学院成都生物所成都610041

在嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)中,解旋酶dnaB和引物酶dnaG组成的引发体在复制叉处解旋双链DNA,并且对于合成冈崎片段(Okazaki fragment)极其重要。引物酶dnaG(P16)的C末端的一个解旋酶相互作用结构域从结构和功能上... 详细信息

在嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)中,解旋酶dnaB和引物酶dnaG组成的引发体在复制叉处解旋双链DNA,并且对于合成冈崎片段(Okazaki fragment)极其重要。引物酶dnaG(P16)的C末端的一个解旋酶相互作用结构域从结构和功能上调控这个相互作用。解旋酶dnaB的N末端和C末端的9个氨基酸残基及其连接区会影响dnaB和dnaG的相互作用。从蛋白质结构域和功能等方面阐述嗜热脂肪芽孢杆菌dnaB-dnaG复合物调控机理和研究进展。

关键词：引物酶解旋酶复制叉复合体调控机制

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