急性病毒性坏死病毒引物酶基因克隆、表达及相关功能分析
作者单位：中国海洋大学
学位级别：硕士
导师姓名：王崇明;潘鲁青
授予年度：2013年
摘 要：栉孔扇贝（Chlamysfarreri）是我国北方沿海重要的优良养殖经济贝类之一，其规模化养殖已有30多年，给我国山东半岛和辽东半岛等沿海地区带来了可观的经济效益，1990年以来，我国北方养殖海区连年暴发栉孔扇贝大规模死亡（死亡率在90%以上），从而使栉孔扇贝养殖业蒙受巨大的经济损失，严重影响了贝类产业的可持续发展。多年研究发现，引发我国北方养殖海区栉孔扇贝夏季大规模死亡的病原就是急性病毒性坏死病毒（acuteviralnecrosisvirus，AVNV），此病毒是呈球形的双链DNA病毒，它主要分布于扇贝外套膜、消化腺、肠和肾脏间质组织细胞和结缔组织细胞中，任伟成等完成了AVNV全基因组测序，在AVNV全基因组预测的潜在开放阅读框（openreadingframes，ORF）中，发现与AVNV的DNA复制、核酸修饰与代谢及病毒与宿主相互作用相关的ORF有44个。其中ORF024编码的引物酶基因参与病毒DNA复制。引物酶（primase）是一种存在于生物及病毒体内的RNA聚合酶，它与DNA的复制和病毒活性密切相关。为确定ORF024能否编码特定的、具有功能的引物酶，以及编码的引物酶是否在AVNV中感染、复制以及在急性病毒性坏死症（acuteviralnecrosisDisease，AVND）暴发中发挥作用，作者根据AVNV引物酶基因设计特异性引物进行扩增AVNV引物酶ORF024，并构建引物酶基因的原核表达载体，在E.coli中进行原核表达、纯化并对重组引物酶进行酶学活性分析。然后利用绿茶提取物（茶多酚）对AVNV引物酶的抑制作用，来探讨茶多酚抗病毒的作用机理。此外，利用AVNV感染栉孔扇贝，通过相对实时荧光定量PCR分析不同组织在不同时间的引物酶基因表达情况，在mRNA水平上进行转录与时序表达分析，探讨AVNV引物酶基因对AVNV在扇贝体内复制的影响，同时在AVNV病毒提取液中加入茶多酚再进行感染栉孔扇贝，通过实时荧光定量PCR分析不同组织在不同时间的引物酶基因表达，探讨茶多酚对AVNV在扇贝体内复制的抑制及其抑制效率，从而为茶多酚可能的抗AVNV作用机理提供理论依据。 1．AVNV引物酶基因的克隆及原核表达。根据AVNV基因组序列，设计特异性引物，扩增编码AVNV引物酶的ORF024，经1%琼脂糖凝胶电泳得到一条约1050bp大小的条带，双酶切后将其连接至pET32a中构建重组原核表达载体pET32a-prim，并将其转化至感受态细胞BL21（DE3）中，加IPTG至终浓度1mmol/L，诱导4-5小时后，SDS-PAGE电泳得到一条约60KDa的条带，经Western-blotting及质谱分析确定为重组引物酶。 2．重组引物酶的纯化及酶学活性分析。利用Co2+亲和层析柱对表达的重组引物酶进行纯化，并测定纯化的重组引物酶的活性、底物特异性、不同金属离子及EDTA对其活性的影响。结果表明：在以poly（dC）为单链模板时，重组引物酶对随机引物的合成具有一定的催化活性;AVNV引物酶具有较强的底物特异性，能特异性催化GTP水解;Zn2+、Na+、K+和Mg2+这四种金属离子对重组引物酶的催化活性具有促进作用，Zn2+浓度为0.1mmol/L时促进率为5%，Na+浓度为5mmol/L促进率只为3%。而Mn2+对重组引物酶的催化活性具有明显抑制作用;EDTA对重组引物酶的催化活性具有抑制作用，浓度越高，抑制率越强，EDTA浓度为10mmol/L时，抑制率达12.20%。 3．利用在引物合成反应体系中加入不同浓度的茶多酚溶液，探讨茶多酚对体外重组引物酶活性和引物合成的影响，在茶多酚7.81μg/ml、31.25μg/ml和125μg/ml的浓度作用结果如下：引物酶活性抑制率随茶多酚浓度升高而逐渐增加，浓度125μg/ml时的抑制率达15.03%;引物合成的量随茶多酚浓度升高而逐渐增加，浓度125μg/ml时的促进率达11.79%。 4．通过AVNV病毒粗提液和混合茶多酚的病毒粗提液分别感染栉孔扇贝，利用实时荧光定量技术进行引物酶基因的转录时序分析。分别取感染AVNV病毒和感染混合茶多酚的AVNV病毒0，4，8，16，24，36，48和72h后栉孔扇贝的外套膜和鳃，提取总RNA，反转录，荧光定量PCR。结果发现：AVNV引物酶基因在外套膜和鳃中的表达量分别于16和8h达到最大值;茶多酚（7.81μg/ml）对AVNV引物酶的复制存在一定的抑制作用，在外套膜和鳃中的抑制率分别为5倍和10倍。 结合本实验结果可以得出以下结论：AVNVORF024编码的引物酶具有催化活性，不同金属离子对引物酶活性影响存在差异，如Zn2+和Na+对引物酶活性存在促进作用，而Mn2+和EDTA对引物酶催在强烈抑制作用。同时引物酶基因是一种早期基因，AVNV病毒引物酶基因在栉孔扇贝外套膜和鳃中的最大表达量和最大表达量的时间存在一定的差异，在外套膜中，引物酶基因在16h时表达量达到峰值，而在鳃中为8h。另外，用混合茶多酚的病毒粗提液进行感染栉孔扇贝后，AVNV引物酶基因的表达量明显低于未混合茶多酚的病毒粗提液进行感染栉孔扇贝后的引物酶基因的表达量，说明茶多酚对于AVNV入侵栉孔扇贝存在一定的抑制作用。
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