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大豆异黄酮苷元的制备及抗阿尔茨海默病的活性研究

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大豆异黄酮苷元的制备及抗阿尔茨海默病的活性研究

作者：张磊广东药学院

学位级别：硕士

【目的】制定大豆异黄酮苷元制备工艺及建立质量控制方法;从细胞水平研究其对过氧化氢和β-淀粉样蛋白诱导的PC12细胞氧化损伤和神经毒性的保护作用;利用阿尔茨海默病模型小鼠(AD小鼠),从体内实验研究其对AD小鼠学习记忆能力、抗氧化... 详细信息

【目的】制定大豆异黄酮苷元制备工艺及建立质量控制方法;从细胞水平研究其对过氧化氢和β-淀粉样蛋白诱导的PC12细胞氧化损伤和神经毒性的保护作用;利用阿尔茨海默病模型小鼠(AD小鼠),从体内实验研究其对AD小鼠学习记忆能力、抗氧化能力、神经递质水平、Aβ神经毒性和海马组织损伤的影响,探讨大豆异黄酮苷元抗阿尔茨海默病(AD)的作用及机理,为开发治疗AD的新药提供依据。【方法】 (1)从豆粕中提取总大豆异黄酮;用酸水解法将大豆异黄酮苷转化成苷元,并纯化精制;建立高效液相色谱方法测定异黄酮苷元的含量的方法。 (2)建立过氧化氢和Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤模型。显微镜观察细胞形态变化,并利用MTT法检测细胞存活率及LDH法检测细胞乳酸脱氢酶活力,研究大豆异黄酮苷元对PC12细胞的氧化损伤和Aβ神经毒性损伤的保护作用。 (3)对AD模型小鼠用不同剂量的异黄酮苷元治疗,通过Y-迷宫实验和避暗试验观察AD小鼠学习记忆能力的改善;通过测定血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性、丙二醛(MDA)水平,研究AD小鼠抗氧化能力的改变;③通过测定乙酰胆碱酯酶活性,研究AD小鼠神经递质水平的变化;④通过测定β-分泌酶活力,研究AD小鼠抗Aβ神经毒性的作用;⑤通过脑组织切片,HE染色,观察对AD小鼠海马组织的保护情况。【结果】 (1)本实验确定了一套大豆异黄酮苷元的制备工艺及质量控制方法,异黄酮苷元总含量为70.98%。其中3种苷元含量分别为:染料木素46.59%、大豆苷元21.215%、黄豆黄素3.175%。 (2)用终浓度为150umol/L的H2O2和20umol/Aβ25-35处理正常培养的PC12细胞显微镜下观察,发现细胞受损较严重、细胞形态异常、数量显著减少,PC12细胞存活率为74.10%,与正常对照组相比明显降低(P异黄酮苷元保护组(5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml)细胞贴壁良好,形态正常,活细胞较多,接近正常对照组,培养液中LDH漏出率比损伤组明显减小(P异黄酮苷元治疗后,与模型组相比,用异黄酮苷元组的学习记忆能力提高(P异黄酮苷元,工艺稳定可控,适合规模生产;(2)异黄酮苷元可显著改善H2O2和Aβ25-35诱导引起的PC12细胞形态改变,减轻细胞膜的损伤,提高神经细胞存活率,有较好的神经保护作用;(3)异黄酮苷元能改善AD模型小鼠学习记忆能力,增强抗氧化能力,降低AchE活力以保护神经递质、减轻Aβ神经毒,有良好的抗AD活性。

关键词：阿尔茨海默病异黄酮苷元高效液相色谱法 PC12细胞 AD小鼠

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两相体系超声辅助酶水解法提取异黄酮苷元

广东药学院学报 2013年第5期29卷 525-529页

作者：李翠鸥陈敬荣郑尧杰赵美顺杨红广东省江门市人民医院广东江门529000 广东药学院广东广州510006

目的建立两相体系超声辅助酶水解法转化提取异黄酮苷元的制备工艺。方法采用油相萃取-水相酶解两相体系,通过单因素与正交试验,考察超声时间、温度、酶量、pH值等因素对超声辅助酶水解法提取游离型异黄酮苷元效果的影响,筛选优化提取条... 详细信息

目的建立两相体系超声辅助酶水解法转化提取异黄酮苷元的制备工艺。方法采用油相萃取-水相酶解两相体系,通过单因素与正交试验,考察超声时间、温度、酶量、pH值等因素对超声辅助酶水解法提取游离型异黄酮苷元效果的影响,筛选优化提取条件。结果两相体系超声辅助酶水解法提取异黄酮苷元的最佳工艺条件是:超声时间60 min,超声温度45℃,酶量10 U/100 mL,水解液pH值为5。结论该工艺流程简便,溶剂使用量少,酶解时间短,游离型异黄酮苷元的转化率较高。

关键词：酶水解两相体系超声辅助异黄酮苷元提取

SFE-CO2技术萃取分离异黄酮苷元的研究

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SFE-CO2技术萃取分离异黄酮苷元的研究

异黄酮苷元超声辅助转化提取与制备及抗氧化活性研究

第二届中草药提取关键技术与提取物产业应用研讨会

作者：毛璞肖咏梅孟冬谷克仁李亚平河南工业大学化学化工学院

将分离蛋白乳清废液水解后,用超临界CO技术提取异黄酮苷元。当以乙醇为夹带剂、夹带剂添加比例8%、乙醇/水的体积比70%、萃取压力30MPa、萃取温度60℃、萃取时间120min时,异黄酮的提取率为79.2%。同时ESI/MS确定在提取物中大豆苷元和染... 详细信息

将分离蛋白乳清废液水解后,用超临界CO技术提取异黄酮苷元。当以乙醇为夹带剂、夹带剂添加比例8%、乙醇/水的体积比70%、萃取压力30MPa、萃取温度60℃、萃取时间120min时,异黄酮的提取率为79.2%。同时ESI/MS确定在提取物中大豆苷元和染料木素为主要的异黄酮苷元。

关键词：超临界二氧化碳萃取分离蛋白乳清废液异黄酮苷元

来源： cnki会议评论

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异黄酮苷元超声辅助转化提取与制备及抗氧化活性研究

作者：廖维良广东药学院

学位级别：硕士

大豆异黄酮是在大豆生长过程中所形成的一类次级代谢产物，属于多酚类化合物。异黄酮在大豆中的存在形式为结合型糖苷与游离苷元，结合型糖苷占总量的97%-98%，游离苷元仅占2%-3%。异黄酮具有多种生物活性，游离型异黄酮苷元是其主要活... 详细信息

大豆异黄酮是在大豆生长过程中所形成的一类次级代谢产物，属于多酚类化合物。异黄酮在大豆中的存在形式为结合型糖苷与游离苷元，结合型糖苷占总量的97%-98%，游离苷元仅占2%-3%。异黄酮具有多种生物活性，游离型异黄酮苷元是其主要活性成分，但游离型苷元含量极低，异黄酮苷元的水解转化方法及提取制备一直是人们研究的热点。本文研究从豆粕中提取制备异黄酮苷元及检测其抗氧化活性，主要分为以下三个内容： 1、异黄酮苷元水解转化方法研究及提取工艺条件优化通过单因素与正交设计方法建立了三种异黄酮苷元的提取方法： 1.1两相体系超声辅助水解的方法，最佳工艺条件：超声时间75min，温度60℃，苷元的提取率0.091%。 1.2两相体系超声辅助酶水解的方法，最佳工艺条件：超声时间60min，温度45℃，酶量10U，pH5，苷元提取率0.2138%。 1.3两相体系超声辅助酸水解的方法，最佳工艺条件：超声时间75min，温度55℃，盐酸浓度1.5mol/L，苷元提取率0.1815%。比较三种方法，两相体系超声辅助酶水解的方法苷元提取率最高，并且条件更温和，更高效。 2、异黄酮苷元的纯化制备及含量测定 2.1提取的异黄酮苷元粗品先经过大孔树脂层析，采用梯度洗脱的方法，先用极性较大的醇水洗脱除去油脂、蛋白、无机盐等粘稠杂质，再用极性较小的醇水洗脱苷元。然后采用硅胶柱层析，按TLC条件选择洗脱溶液，进一步纯化苷元，得到高纯度异黄酮苷元。 2.2经HPLC测定，异黄酮苷元最终总纯度为68.53%，其中大豆苷元24.58%，黄豆黄素1.32%，染料木素42.63%。 3、异黄酮苷元抗氧化活性实验 3.1建立HO诱导PC12细胞损伤的模型，从细胞形态学和细胞存活率两方面考察HO诱导PC12细胞损伤的最佳浓度，实验结果表明HO浓度为150μmol/L时，细胞损伤效果显著、稳定，适合用于建立细胞损伤模型。 3.2通过HO诱导PC12细胞损伤的模型，从细胞形态学与细胞存活率两方面考察异黄酮苷元的抗氧化活性，实验结果表明异黄酮苷元的对HO诱导PC12细胞的损伤具有显著的抗氧化保护作用。

关键词：异黄酮苷元两相体系超声辅助抗氧化活性

复合有机酸催化大豆异黄酮糖苷水解成苷元的工艺研究

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粮油食品科技 2016年第5期24卷 35-37页

作者：于丽颖罗亚楠郑凤梅吉林化工学院化学与制药工程学院吉林吉林132022 吉化炼油厂吉林吉林132021

通过单因素实验和正交实验,以水解率为评价指标,研究复合有机酸催化大豆异黄酮糖苷水解成苷元的工艺参数。结果表明,最佳水解工艺为:反应温度135℃,反应时间为160 min,复合酸配比(苹果酸∶柠檬酸)为4∶3,水解率达到97.0%以上。复合有机... 详细信息

通过单因素实验和正交实验,以水解率为评价指标,研究复合有机酸催化大豆异黄酮糖苷水解成苷元的工艺参数。结果表明,最佳水解工艺为:反应温度135℃,反应时间为160 min,复合酸配比(苹果酸∶柠檬酸)为4∶3,水解率达到97.0%以上。复合有机酸催化水解工艺绿色环保,水解产物无需分离,可直接作为保健食品原料,具有较高的应用价值。

关键词：异黄酮糖苷异黄酮苷元复合有机酸水解

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丹贝异黄酮的提取分离与结构鉴定

食品与发酵工业 2001年第3期27卷 1-4页

作者：徐德平江汉湖庞自洁潘福生南京农业大学食品科技学院南京210095 中科院植物研究所南京210014

从丹贝中分离纯化了 3种异黄酮 ,它们分别是染料木素、大豆黄素、黄豆黄素 ,而未分离到 6 ,7,4’ -三羟基异黄酮。丹贝中异黄酮的组成主要是各种苷元 ,证明丹贝生物活性的提高是由于异黄酮由糖苷水解成苷元所致。同时还发现。

关键词：丹贝异黄酮分离纯化异黄酮粮苷异黄酮苷元结构鉴定大豆发酵食品

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大豆异黄酮水解物的制备

中国油脂 2007年第4期32卷 59-61页

作者：周凤超于殿宇关海君白志明东北农业大学食品学院哈尔滨市香坊区木材街59号150030

利用黑曲霉产酶发酵培养基制备β-葡萄糖苷酶,再利用β-葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮粉制备异黄酮苷元。研究结果表明,较优产酶发酵培养基的C/N为6∶4,加水量1.4倍,培养基中不添加诱导物。水解500 mg40%大豆异黄酮粉的最佳条件为:加酶量100... 详细信息

利用黑曲霉产酶发酵培养基制备β-葡萄糖苷酶,再利用β-葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮粉制备异黄酮苷元。研究结果表明,较优产酶发酵培养基的C/N为6∶4,加水量1.4倍,培养基中不添加诱导物。水解500 mg40%大豆异黄酮粉的最佳条件为:加酶量100 U,水解温度50℃,水解时间1 h。

关键词：大豆异黄酮水解异黄酮苷元 β-葡萄糖苷酶

保健食品中大豆异黄酮含量的高效液相色谱法测定

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食品科技 2008年第8期33卷 191-196页

作者：张艳舫王晶傅博强河北省畜牧良种站工作站石家庄050061 中国计量科学研究院生物、能源与环境研究所北京100013

采用高效液相色谱法,对市场上销售的5种国产和进口大豆异黄酮保健食品中12种大豆异黄酮的含量进行测定。对3种苷元大豆素、黄豆素和染料木素,3种糖苷大豆苷、黄豆苷、染料木苷采用各自的标准品绘制标准曲线用内标法进行定量,对乙酰化或... 详细信息

采用高效液相色谱法,对市场上销售的5种国产和进口大豆异黄酮保健食品中12种大豆异黄酮的含量进行测定。对3种苷元大豆素、黄豆素和染料木素,3种糖苷大豆苷、黄豆苷、染料木苷采用各自的标准品绘制标准曲线用内标法进行定量,对乙酰化或丙二酰化糖苷用对应糖苷的内标响应因子和转换因子来计算含量。结果表明,大豆异黄酮保健食品的质量参差不齐,存在着含量标示不准确的问题,甚至部分完全不含有大豆异黄酮,亟待加强对大豆异黄酮保健食品的市场监管。

关键词：保健食品大豆异黄酮异黄酮苷元糖苷大豆苷高效液相色谱

纯种发酵淡豆豉抑制血管紧张素转化酶和抗抑郁作用的研究

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纯种发酵淡豆豉抑制血管紧张素转化酶和抗抑郁作用的研究

作者：马书伟江西中医药大学

学位级别：硕士

目的对纯种发酵淡豆豉进行质量和安全性评价,研究纯种发酵淡豆豉对血管紧张素转换酶(ACE)的抑制作用、抗抑郁作用及其有效组分,为研发具有降血压、抗抑郁功效的纯种发酵淡豆豉提供科学依据。方法一、淡豆豉的制备及其质量和安全性评价(... 详细信息

目的对纯种发酵淡豆豉进行质量和安全性评价,研究纯种发酵淡豆豉对血管紧张素转换酶(ACE)的抑制作用、抗抑郁作用及其有效组分,为研发具有降血压、抗抑郁功效的纯种发酵淡豆豉提供科学依据。方法一、淡豆豉的制备及其质量和安全性评价(一)淡豆豉的制备和质量评价1、按实验室前期已建立的淡豆豉自然发酵和纯种发酵工艺,分别获取发酵不同时间点的样本及成品淡豆豉。2、建立HPLC法测定各样本中大豆苷元和染料木素的含量。3、建立UPLC-MS法测定各样本中γ-氨基丁酸(GABA)的含量。4、采用显色、薄层鉴别、含量测定等方法,检测自制淡豆豉和市场不同产地淡豆豉的性状、大豆苷元、染料木素、GABA含量,为完善淡豆豉质量标准提供依据。(二)淡豆豉的安全性评价1、建立UPLC-MS/MS检测自然发酵淡豆豉各样本中4种黄曲霉毒素(AFTs)[黄曲霉毒素B(AFB),AFB,AFG,AFG]含量。2、采用常规小鼠经口急性毒性实验对纯种发酵淡豆豉进行安全性评价。二、淡豆豉的药理学研究(一)淡豆豉对ACE的抑制作用及其活性成分的分析1、淡豆豉中异黄酮和GABA提取物的制备:分别用70%乙醇和超声水提取制备各样本的异黄酮提取物和GABA提取物。2、ACE体外抑制实验及其活性成分的分析采用Cushman测定法加以改进,以马脲酰-组氨酰-亮氨酸(Hip-His-Leu,HHL)为底物,紫外分光光度计测定,计算各样本的ACE抑制率;通过SPSS软件对淡豆豉发酵过程中各时间点样本的异黄酮、GABA含量与ACE抑制率进行相关性分析,并比较纯种发酵淡豆豉和自然发酵淡豆豉对ACE的抑制作用。(二)淡豆豉的抗抑郁作用研究1、淡豆豉抗抑郁作用有效部位的初步筛选(1)淡豆豉不同极性部位的提取:将淡豆豉粉末用75﹪乙醇回流提取,得总提取液,用大孔吸附树脂柱层析分离,用水和不同浓度的乙醇洗脱,即得淡豆豉不同极性部位提取物。(2)筛选抗抑郁效果好的极性部位:用强迫游泳、悬尾试验、敞箱实验评价淡豆豉不同极性部位的抗抑郁活性,筛选出抗抑郁效果更为显著的淡豆豉提取物。2、淡豆豉的抗抑郁作用和成分分析(1)按实验室已建立的方法制备小鼠CUMS抑郁模型,通过检测各给药组小鼠的行为学指标和海马CA1区病理学变化,比较纯种发酵和自然发酵淡豆豉的抗抑郁作用。(2)质谱分析淡豆豉抗抑郁作用的有效成分。结果一、淡豆豉的质量评价1、显色、薄层鉴别结果:纯种发酵和自然发酵淡豆豉在显色反应中,均显紫红色;在薄层鉴别中,均出现了与对照品相同位置的荧光斑点。2、淡豆豉自然发酵过程中,染料木素、大豆苷元的含量随发酵时间的增加也随之增加,至“再闷”12天时含量最高(染料木素:1.040 mg/g,大豆苷元:1.160mg/g)。自然发酵淡豆豉成品大豆苷元和染料木素的含量分别为0.787 mg/g、0.886mg/g。纯种发酵淡豆豉在发酵过程中,染料木素、大豆苷元含量逐渐升高,在发酵15天时含量最高,分别为染料木素:0.185 mg/g,大豆苷元:0.223 mg/g。均符合《中国药典》2020年版要求。3、淡豆豉自然发酵过程中,GABA含量在发酵前期很低或检测不出,进入“再闷”阶段含量迅速升高,至“再闷”15天时达到最高,为7.94 mg/g;淡豆豉纯种发酵过程中。随着发酵时间的增加,GABA含量逐渐升高,至发酵15天时含量最高,为6.03 mg/g。4、11批不同产地淡豆豉中大豆苷元、染料木素、GABA含量差别较大,其中有4批淡豆豉的大豆苷元、染料木素含量不符合药典规定,来自安徽3的淡豆豉中大豆苷元、染料木素、GABA含量最高,分别为0.875、1.117、5.336 mg/g。二、淡豆豉的安全性评价1、4种黄曲霉毒素(AFTs)含量在淡豆豉自然发酵过程中呈先上升后下降的趋势,从发酵第3天起检测到AFTs,到“再闷”第6天达最高,为6.95μg/kg,“再闷”第9天检测到较低含量的AFTs,为1.2μg/kg,“再闷”第12天、第15天均未检测到AFTs。2、用浓度为2.25 g/m L、最大灌胃体积40.0 m L/kg(成人给药剂量的50倍)的纯种发酵淡豆豉煎煮液灌胃小鼠,观察14天。小鼠的体重、进食、皮毛、脏器等与空白组比较无明显变化,表明纯种发酵淡豆豉毒性极小或没有毒性。三、淡豆豉的药理学研究(一)淡豆豉对ACE的抑制作用及其活性成分的分析分析淡豆豉发酵过程中大豆苷元、染料木素、GABA含量与ACE抑制率相关性,结果显示,发酵过程不同时间点样本中异黄酮提取物的ACE抑制率低且无明显变化(r0.05),“再闷”后各样本的GABA提取物对ACE抑制作用明显,最高达90.86%,且GABA含量与ACE抑制率呈正相关(r>0.99,p<0.05)。推测GABA是淡豆豉抑制ACE的主要成分。纯种发酵淡豆豉总提物有

关键词：淡豆豉自然发酵纯种发酵异黄酮苷元 γ-氨基丁酸血管紧张素转化酶抗抑郁作用有效成分