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食品与发酵工业 2023年第23期49卷 16-24页

作者：赵婉莹周景文侯颖天津科技大学生物工程学院天津300000 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

8-异戊烯基山奈酚(8-prenylkaempferol,8-pk)是一种黄酮类化合物,具有抗炎、抗癌等药理活性。目前8-pk的生物合成主要通过植物来源的异戊烯基转移酶(prenyltransferases,PTs)催化山奈酚(kaempferol,Kae)实现。然而植物源的PTs自身含有... 详细信息

8-异戊烯基山奈酚(8-prenylkaempferol,8-pk)是一种黄酮类化合物,具有抗炎、抗癌等药理活性。目前8-pk的生物合成主要通过植物来源的异戊烯基转移酶(prenyltransferases,PTs)催化山奈酚(kaempferol,Kae)实现。然而植物源的PTs自身含有的信号肽会极大阻碍其在原核生物中异源表达和高效催化,且催化途径中前体物质二甲基烯丙基焦磷酸盐(dimethylallyl pyrophosphate,DMAPP)的供给不足严重限制了8-pk的生物合成产量。该研究以大肠杆菌(Escherichia coli)为底盘细胞,通过强化前体DMAPP供应和截短异戊烯基转移酶信号肽实现了8-pk的高效合成。首先,在*** BL21(DE3)中游离表达了淫羊藿来源的异戊烯基转移酶(EkF8DT),并引入异戊烯醇利用途径提升了EkF8DT的前体DMAPP的供应,8-pk产量达到2.14 mg/L。随后,通过AlphaFold2预测了EkF8DT的结构,将EkF8DT N端截短60个氨基酸时8-pk产量最高,达到6.46 mg/L。通过将EkF8DT的N端融合蛋白质标签以及优化发酵条件产量达到24.28 mg/L,最终在5 L发酵罐中8-pk产量达到44.33 mg/L,这是目前报道的较高水平。该研究为8-pk等类黄酮异戊烯基化的高效生物合成提供了策略。

关键词： 8-异戊烯基山奈酚异戊烯基转移酶异戊烯醇利用途径信号肽截短蛋白质标签

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α-法尼烯在毕赤酵母中的生物合成

α-法尼烯在毕赤酵母中的生物合成

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作者：刘慧江南大学

学位级别：硕士

微生物利用可再生原料生产α-法尼烯(α-farnesene)是一种有前途的替代传统石油基工艺的方法。尽管已经报道α-法尼烯可以通过模式菌株如大肠杆菌(Escherichia coli)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)异源合成,但是难以实现高密度... 详细信息

微生物利用可再生原料生产α-法尼烯(α-farnesene)是一种有前途的替代传统石油基工艺的方法。尽管已经报道α-法尼烯可以通过模式菌株如大肠杆菌(Escherichia coli)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)异源合成,但是难以实现高密度发酵。毕赤酵母(Pichia pastoris)是生产类异戊二烯的良好平台,可实现高密度培养,具有大规模生产α-法尼烯的潜力。此外,目前改善微生物中合成α-法尼烯的策略主要集中于细胞质工程,而很少有关于多个亚细胞区室综合工程的报道。在本研究中,提出对细胞质和过氧化物酶体的双重代谢调控共同促进毕赤酵母中α-法尼烯的合成的策略。经过混合碳源培养和发酵条件优化,摇瓶中α-法尼烯的产量达到2.81±0.05 g·L。在这项研究中,提出有效策略实现α-法尼烯在毕赤酵母中高效合成,这可能为其他增值化学品的生物生产开辟新的可能性。主要研究结果如下:(1)基于毕赤酵母细胞质进行一系列代谢工程促进α-法尼烯的生物合成。首先构建α-法尼烯合成酶(α-farnesene synthase,AFS)的系统进化树,选取20种来源于不同植物的AFSs以筛选最适用于在毕赤酵母中合成α-法尼烯的AFS,然后过表达甲羟戊酸途径(mevalonate pathway,MVA)和α-法尼烯合成途径的限速酶以及增加乙酰辅酶A的供应,最终获得细胞质工程菌株X33-6,α-法尼烯产量为1.07±0.03 g·L。(2)首次证明了异戊烯醇利用途径(isopentenol utilization pathway,IUP)可以作为异戊二烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate,DMAPP)合成的两步捷径在毕赤酵母过氧化物酶体中促进α-法尼烯的高效合成。将IUP引入到毕赤酵母过氧化物酶体中,IUP激活后的菌株X33-CHKLIPK-e PTS1与对照菌株X33相比,IPP+DMAPP库显著提高了6.8倍。在此基础上,引入下游α-法尼烯合成途径并优化关键酶基因拷贝数得到过氧化物酶体工程菌株X33-8,α-法尼烯产量达1.69±0.06 g·L。与对照菌株X33-AFS-e PTS1相比,α-法尼烯产量显著提高了2.2倍,实现了α-法尼烯的高效合成。(3)细胞质和过氧化物酶体的双重代谢调控共同促进α-法尼烯在毕赤酵母中的过量合成。双重代谢调控的重组菌株X33-10中α-法尼烯的产量为2.18±0.04 g·L,分别是单独过氧化物酶体工程菌株X33-8和单独细胞质工程菌株X33-6的1.3倍和2.0倍。(4)混合碳源培养以及发酵条件优化可改善细胞生长以及提高α-法尼烯的产量。当山梨醇作为辅助碳源且油酸组分为0.5(C-mol油酸:C-mol山梨醇)时,取得最高的α-法尼烯产量达2.51±0.04 g·L。基于优化的培养条件,菌株X33-10最终α-法尼烯产量为2.81±0.05 g·L,转化率为0.15 g·g。

关键词： α-法尼烯毕赤酵母异戊烯醇利用途径过氧化物酶体混合碳源培养

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代谢工程改造提高毕赤酵母大麻酚萜酸产量及大麻酚萜酸合成酶的挖掘

代谢工程改造提高毕赤酵母大麻酚萜酸产量及大麻酚萜酸合成酶的挖...

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作者：顾淞洁华南理工大学

学位级别：硕士

大麻中含有500多种化合物,其主要活性成分大麻素已在慢性疼痛、癌症、癫痫、肌萎缩侧索硬化等疾病中展现和发挥出了独特的疗效。大麻酚萜酸(CBGA)是大麻素的母体,利用微生物细胞工程高效合成CBGA对于促进大麻素的工业化应用具有重要意... 详细信息

大麻中含有500多种化合物,其主要活性成分大麻素已在慢性疼痛、癌症、癫痫、肌萎缩侧索硬化等疾病中展现和发挥出了独特的疗效。大麻酚萜酸(CBGA)是大麻素的母体,利用微生物细胞工程高效合成CBGA对于促进大麻素的工业化应用具有重要意义。毕赤酵母属于甲基营养型酵母,具有强启动子、高密度发酵、高效外源蛋白表达、可在廉价培养基中生长等优势,具有生产大麻酚萜酸的潜力。本研究以一株大麻酚萜酸合成毕赤酵母菌株GMva07为出发菌,通过优化关键酶拷贝数、解除限速步骤、强化前体乙酰辅酶A供应、删除竞争途径、过氧化物酶体区室工程等策略,有效地提高了毕赤酵母大麻酚萜酸的产量。此外,结合已有的大麻酚萜酸合成酶序列信息,对NCBI数据库中潜在的大麻酚萜酸合成酶序列进行挖掘,挖掘到2条潜在的大麻酚萜酸合成酶。主要研究结果以下:(1)对毕赤酵母过氧化物酶体进行改造,将异戊烯醇利用(IUP)途径引入毕赤酵母过氧化物酶体,在此基础上引入下游大麻酚萜酸合成途径并优化关键酶的拷贝数得到菌株GMIup04,大麻酚萜酸产量比出发菌株提高了56%,达到1.23 mg/l。(2)基于毕赤酵母细胞质代谢工程改造,促进大麻酚萜酸合成。首先,设计ERG20和Nph B的融合蛋白以增加关键基因拷贝数;接着,为了解除甲羟戊酸(MVA)途径反馈抑制,过表达MVA途径限速酶HMGR;同时,考虑到乙酰辅酶A是MVA途径的起始反应物,外源引入不同来源的柠檬酸裂解酶(ACL)基因和Ec PDH,以积累细胞质乙酰辅酶A的含量;最后,削弱了乙醇代谢途径,进一步优化了产量,使大麻酚萜酸的产量达到19.04±0.24 mg/l,与出发菌GMva07相比提高了近25倍。(3)通过挖掘NCBI数据库序列信息,成功挖掘到两条潜在的大麻酚萜酸合成酶序列Ptfst和St PT2。其中Ptfst已成功在大肠杆菌重组系统异源表达。使用LC-MS对Pftst的催化产物分析发现,在ESI(-)模式下,Ptfst催化产物其质荷比与Nph B(WT)副产物2-O-GOA(2-O-香叶基橄榄酸)质荷比一致,初步判断,Ptfst可以催化OA和GPP得到CBGA的同分异构体2-O-GOA。

关键词：毕赤酵母大麻酚萜酸异戊烯醇利用途径细胞器工程基因挖掘

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烟草香味前体物西柏三烯醇的异源合成

烟草香味前体物西柏三烯醇的异源合成

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作者：李乾郑州轻工业大学

学位级别：硕士

烟草西柏三烯醇主要包括西柏三烯一醇(Cembratrien-ol,CBT-ol)以及西柏三烯二醇(Cembratrien-diol,CBT-diol)均属于二萜类化合物,主要存在于烟草属植物叶片和花的分泌物中。西柏三烯一醇具有良好的杀虫活性,对烟草植株的正常生长起到了... 详细信息

烟草西柏三烯醇主要包括西柏三烯一醇(Cembratrien-ol,CBT-ol)以及西柏三烯二醇(Cembratrien-diol,CBT-diol)均属于二萜类化合物,主要存在于烟草属植物叶片和花的分泌物中。西柏三烯一醇具有良好的杀虫活性,对烟草植株的正常生长起到了重要的作用。西柏三烯二醇在烟叶的生长和调制过程中,可降解为茄酮、氧化茄酮以及酮酸等物质,对于提高卷烟香气、凸显卷烟风格具有重要价值。传统的植物提取方式存在原料来源受限且工艺复杂等问题;化学合成法产量极低,目前不能用于工业化规模合成。而采用生物合成法生产西柏三烯醇,具有合成周期短、原料来源简单且容易规模放大的优点。本文以大肠杆菌Escherichia ***21(DE3)为宿主,构建合成西柏三烯醇的工程菌株,主要研究内容如下:(1)大肠杆菌引入西柏三烯醇合成关键酶的研究通过扩增西柏三烯一醇合成关键基因构建重组质粒p HBI;在此基础上结合电子通道策略构建了重组质粒p DZTD。结合课题组之前的研究,将重组质粒p CTI、p AEIG以及p HBI同时转化至大肠杆菌*** BL21(DE3)-Δaph A-Δyqa B以及*** BL21(DE3)-Δaph A-Δyqa B-Δpho A中,从而构建合成西柏三烯一醇的工程菌株*** CBT01和*** CBT02;将重组质粒p CTI、p AEIG以及p DZTD同时转化至大肠杆菌*** BL21(DE3)-Δaph A-Δyqa B以及*** BL21(DE3)-Δaph A-Δyqa B-Δpho A中,从而构建合成西柏三烯二醇的工程菌株*** CBTD01和*** CBTD02。通过摇瓶发酵验证所构建的工程菌株具备合成西柏三烯一醇或西柏三烯二醇的能力。其中*** CBT01和*** CBT02在摇瓶中发酵36 h分别能够合成90.48±3.91、158.34±2.27 mg/L的西柏三烯一醇;在*** CBTD01以及*** CBTD02的摇瓶发酵液中均能够检测出痕量的西柏三烯二醇。(2)工程菌株合成西柏三烯一醇发酵条件的优化为提高*** CBT02工程菌株西柏三烯一醇的合成水平,对合成方式、碳源、蛋白诱导温度以及IPTG诱导浓度依次进行优化。实验结果表明:较于全细胞催化的方式,工程菌株*** CBT02更适合传统发酵的方法合成西柏三烯一醇,发酵36 h摇瓶发酵的产量为全细胞催化产量的1.86倍;以甘油为唯一碳源摇瓶发酵36 h,其西柏三烯一醇的产量是以葡萄糖为唯一碳源产量的7倍;蛋白诱导温度对工程菌株合成西柏三烯一醇具有极为明显的影响,通过实验发现最适蛋白诱导温度为16℃;最适IPTG诱导浓度为0.1 m M。在上述优化后的条件下,工程菌株*** CBT02通过摇瓶发酵72 h时能够生产581.26±10.16 mg/L的西柏三烯一醇,转化率为27.6%。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验结果表明在上述条件下,西柏三烯一醇合成路径关键酶所表达的蛋白溶解性较高,验证了优化后发酵条件的适宜性。(3)西柏三烯一醇小试发酵工艺的初步探索利用工程菌株*** CBT02在5 L发酵罐中进行西柏三烯一醇生物合成小试工艺的初步探索。通过对比不同碳源以及底物添加方式,在以葡萄糖为碳源、异戊烯醇分三次加入的条件下能够获得较高产量的西柏三烯一醇(1.16 g/L),是目前以大肠杆菌为宿主生物合成西柏三烯一醇的最高水平。该研究为将来工业化生产奠定了理论基础。

关键词：西柏三烯醇生物合成大肠杆菌异戊烯醇利用途径

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