代谢工程改造提高毕赤酵母大麻酚萜酸产量及大麻酚萜酸合成酶的挖掘

作     者：顾淞洁 

作者单位：华南理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：林影

授予年度：2022年

学科分类：081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：毕赤酵母 大麻酚萜酸 异戊烯醇利用途径 细胞器工程 基因挖掘 

摘      要：大麻中含有500多种化合物,其主要活性成分大麻素已在慢性疼痛、癌症、癫痫、肌萎缩侧索硬化等疾病中展现和发挥出了独特的疗效。大麻酚萜酸(CBGA)是大麻素的母体,利用微生物细胞工程高效合成CBGA对于促进大麻素的工业化应用具有重要意义。毕赤酵母属于甲基营养型酵母,具有强启动子、高密度发酵、高效外源蛋白表达、可在廉价培养基中生长等优势,具有生产大麻酚萜酸的潜力。本研究以一株大麻酚萜酸合成毕赤酵母菌株GMva07为出发菌,通过优化关键酶拷贝数、解除限速步骤、强化前体乙酰辅酶A供应、删除竞争途径、过氧化物酶体区室工程等策略,有效地提高了毕赤酵母大麻酚萜酸的产量。此外,结合已有的大麻酚萜酸合成酶序列信息,对NCBI数据库中潜在的大麻酚萜酸合成酶序列进行挖掘,挖掘到2条潜在的大麻酚萜酸合成酶。主要研究结果以下:(1)对毕赤酵母过氧化物酶体进行改造,将异戊烯醇利用(IUP)途径引入毕赤酵母过氧化物酶体,在此基础上引入下游大麻酚萜酸合成途径并优化关键酶的拷贝数得到菌株GMIup04,大麻酚萜酸产量比出发菌株提高了56%,达到1.23 mg/l。(2)基于毕赤酵母细胞质代谢工程改造,促进大麻酚萜酸合成。首先,设计ERG20和Nph B的融合蛋白以增加关键基因拷贝数;接着,为了解除甲羟戊酸(MVA)途径反馈抑制,过表达MVA途径限速酶HMGR;同时,考虑到乙酰辅酶A是MVA途径的起始反应物,外源引入不同来源的柠檬酸裂解酶(ACL)基因和Ec PDH,以积累细胞质乙酰辅酶A的含量;最后,削弱了乙醇代谢途径,进一步优化了产量,使大麻酚萜酸的产量达到19.04±0.24 mg/l,与出发菌GMva07相比提高了近25倍。(3)通过挖掘NCBI数据库序列信息,成功挖掘到两条潜在的大麻酚萜酸合成酶序列Ptfst和St PT2。其中Ptfst已成功在大肠杆菌重组系统异源表达。使用LC-MS对Pftst的催化产物分析发现,在ESI(-)模式下,Ptfst催化产物其质荷比与Nph B(WT)副产物2-O-GOA(2-O-香叶基橄榄酸)质荷比一致,初步判断,Ptfst可以催化OA和GPP得到CBGA的同分异构体2-O-GOA。