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庚二酸的生物合成研究

庚二酸的生物合成研究

作者：鲍青青江南大学

学位级别：硕士

庚二酸是一种重要的二元羧酸,广泛应用于化工、医药及配位化学等多个领域,是制备生物素、润滑油及聚酰胺的重要原料。目前工业上主要通过水杨酸裂解法来制备庚二酸,该方法存在反应条件严格,工艺流程复杂及环境污染严重等缺点。近年来,... 详细信息

庚二酸是一种重要的二元羧酸,广泛应用于化工、医药及配位化学等多个领域,是制备生物素、润滑油及聚酰胺的重要原料。目前工业上主要通过水杨酸裂解法来制备庚二酸,该方法存在反应条件严格,工艺流程复杂及环境污染严重等缺点。近年来,生物法合成庚二酸受到了广泛的关注,庚二酸的生物合成机理也逐步被阐明。然而,现有的报道中工程菌株的庚二酸产量均较低,不利于工业化生产。为了解决这一问题,本课题做了以下研究:(1)庚二酸生物合成途径的构建。首先以课题组前期研究为基础,选择菌株B和B3为研究对象,在大肠杆菌中验证了逆己二酸降解途径(RADP)合成庚二酸的可行性。由于在大肠杆菌中庚二酸通常用于合成生物素,为了抑制其下游代谢途径,利用CRISPR-Cas9技术敲除宿主菌株B和B3中的基因bioF,构建了新的宿主菌株B1和B4。随后在现有的四株宿主菌株中过表达RADP途径中的五种酶,摇瓶发酵结果显示单独敲除bioF对菌株合成庚二酸有积极的影响,最终菌株B1-146在外加50 mM戊二酸时合成了12.0 mg·L庚二酸。(2)强化戊二酰辅酶A的供应。本研究在菌株B1-146中表达了戊二酸转运蛋白PA5530和辅酶A转移酶Cat1和CaiB,以期提高胞内戊二酰辅酶A的水平。摇瓶发酵结果表明在RADP途径合成庚二酸的基础上,仅表达戊二酸转运蛋白可以提高菌株生产庚二酸的能力。通过进一步优化外加戊二酸的浓度,结果发现当外加戊二酸浓度为10 mM时,过表达PA5530的菌株B1-146P的庚二酸产量最高。(3)同工酶组合以优化庚二酸的合成途径。首先通过文献调研挖掘了RADP途径的同工酶,在菌株B1中通过过表达构建了BIOZ途径,并验证了利用该途径合成庚二酸的可行性。随后对RADP和BIOZ途径的酶进行组合,通过摇瓶发酵发现当过表达bioZ、fab G、Tfu＿0067、Tfu＿1647和Tfu＿2576-2577时,菌株B1的庚二酸产量最高,为36.7 mg·L,这也是目前利用克莱森缩合反应合成庚二酸的最高产量。(4)庚二酸生产菌株的筛选及发酵优化。本研究通过48孔板及摇瓶筛选得到一株产庚二酸的霍氏肠杆菌Bpa-3,摇瓶发酵时该菌株可产生115.4 mg·L庚二酸。随后分别对培养基成分、接种量及外加无机盐的浓度进行了优化,结果发现当以甘油为碳源,胰蛋白胨为氮源,接种量为4%并外加30 mM KHPO时,庚二酸的产量最高,为217.3 mg·L,是优化前的1.89倍。

关键词：庚二酸大肠杆菌克莱森缩合反应霍氏肠杆菌发酵优化

利用太赫兹光谱和密度泛函理论研究烟酰胺-庚二酸共晶体的多晶型

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光谱学与光谱分析 2019年第5期39卷 1386-1391页

作者：肖田田唐汉秦张卓勇郭长彬王果廖奕首都师范大学化学系北京100048

烟酰胺,又称为维生素PP,是辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ的组成部分,是许多脱氢酶的辅酶。庚二酸是一种广泛使用的共晶体前体。烟酰胺与庚二酸形成的药物共晶体具有两种不同的多晶型,分别为晶型Ⅰ和晶型Ⅱ。不同的药物晶型常常具有不同的物理化学性质... 详细信息

烟酰胺,又称为维生素PP,是辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ的组成部分,是许多脱氢酶的辅酶。庚二酸是一种广泛使用的共晶体前体。烟酰胺与庚二酸形成的药物共晶体具有两种不同的多晶型,分别为晶型Ⅰ和晶型Ⅱ。不同的药物晶型常常具有不同的物理化学性质,这些差异可能会对药物的溶出速率、稳定性以及药效具有较大影响,因此在药物领域中寻找合适的技术手段鉴别药物的不同晶型非常重要。利用太赫兹时域光谱在室温下对烟酰胺-庚二酸的两种共晶体在0.2～2.2 THz范围内进行检测,发现两者的特征吸收峰具有明显的差异,晶型Ⅰ在1.51, 1.73, 1.94, 2.01和2.17 THz有五个特征吸收峰,其中在1.94, 2.01和2.17 THz处是三个吸收强度较大的峰,而晶型Ⅱ在1.66, 1.74, 1.88, 2.02和2.16 THz有五个特征吸收峰,与晶型Ⅰ不同的是在2.02和2.16 THz处有两个强度较大的吸收峰。利用密度泛函理论对烟酰胺-庚二酸两种共晶体进行理论计算,计算结果表明实验峰与理论峰基本对应,对吸收峰指认归属表明特征吸收峰来源于分子骨架的振动与包含氢键的振动。研究结果表明太赫兹时域光谱技术对于区分药物共晶体的多晶型现象具有重要的应用。

关键词：烟酰胺庚二酸共晶体多晶型太赫兹时域光谱密度泛函理论

庚二酸/硬脂酸钙双组分成核剂对β晶型等规聚丙烯生成的影响

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高分子材料科学与工程 2008年第9期24卷 76-79页

作者：窦强南京工业大学材料科学与工程学院高分子系江苏南京210009

研究了在120℃等温结晶30min的条件下，庚二酸／硬脂酸钙组成比对等规聚丙烯中β晶型含量的影响，发现在0．15％（质量分数）庚二酸用量下，随着硬脂酸钙用量的增加，β晶型含量不断增大，硬脂酸钙用量在0．35％（质量分数）以上时，才... 详细信息

研究了在120℃等温结晶30min的条件下，庚二酸／硬脂酸钙组成比对等规聚丙烯中β晶型含量的影响，发现在0．15％（质量分数）庚二酸用量下，随着硬脂酸钙用量的增加，β晶型含量不断增大，硬脂酸钙用量在0．35％（质量分数）以上时，才能生成较高纯度的β晶型聚丙烯，说明iPP和双组分成核剂熔体混合时，庚二酸和硬脂酸钙可能“就地”发生化学反应，生成高效13晶型成核剂——庚二酸钙。还研究了在0．15％庚二酸／10．5％硬脂酸钙固定组成比下，等温结晶温度（100℃～140℃）对iPP中β晶型含量的影响，发现在130℃～140℃之间发生β→α晶型转变。

关键词：聚丙烯 β晶型成核剂庚二酸结晶硬脂酸钙

庚二酸类成核剂种类和结晶温度对等规聚丙烯中β晶型的影响——Ⅰ 庚二酸、庚二酸镁和庚二酸铝的影响

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高分子材料科学与工程 2007年第3期23卷 163-166,170页

作者：窦强南京工业大学材料科学与工程学院高分子系江苏南京210009

研究了结晶温度（100℃-140℃）对庚二酸、庚二酸镁、庚二酸铝成核等规聚丙烯中β晶型生成的影响。发现聚丙烯熔体在120℃或130℃下等温结晶,可以产生β晶型。庚二酸是低活性β晶型成核剂,生成的β晶型不稳定,易在加热时转变为α晶型,造... 详细信息

研究了结晶温度（100℃-140℃）对庚二酸、庚二酸镁、庚二酸铝成核等规聚丙烯中β晶型生成的影响。发现聚丙烯熔体在120℃或130℃下等温结晶,可以产生β晶型。庚二酸是低活性β晶型成核剂,生成的β晶型不稳定,易在加热时转变为α晶型,造成DSC熔融峰变宽。庚二酸镁也是低活性β晶型成核剂,生成的β晶型含量低。庚二酸铝不是β晶型成核剂,对β晶型的生成有抑制作用。

关键词：聚丙烯庚二酸成核剂 β晶型结晶温度

纳米碳酸钙/庚二酸复合成核剂对热致相分离法制备聚丙烯微孔膜的影响

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高分子学报 2006年第7期16卷 866-872页

作者：罗本张军王晓琳温建志南京工业大学材料科学与工程学院南京210009 清华大学化学工程系北京100084 山东招远膜天集团有限公司招远265400

以大豆油，邻苯二甲酸二丁酯（DBP）为混合稀释剂，采用热致相分离法（TIPS）制备聚丙烯（PP）微孔膜．研究了纳米碳酸钙成核剂、纳米碳酸钙／庚二酸复合成核剂对PP／大豆油／DBP（30／42／28，质量比）混合体系中PP结晶、熔融性能和PP... 详细信息

以大豆油，邻苯二甲酸二丁酯（DBP）为混合稀释剂，采用热致相分离法（TIPS）制备聚丙烯（PP）微孔膜．研究了纳米碳酸钙成核剂、纳米碳酸钙／庚二酸复合成核剂对PP／大豆油／DBP（30／42／28，质量比）混合体系中PP结晶、熔融性能和PP微孔膜微观结构的影响．结果表明，单-纳米碳酸钙成核剂加入量为PP的0％-4％（质量百分率）时，PP／DBP／大豆油体系中PP熔融曲线上对应的峰值温度（Tm^p）降到150．7-151．3℃，而纯PP的熔融峰值温度为165℃；DSC实验结果还显示加入1％-4％纳米碳酸钙和0．5％庚二酸后，导致PP的熔融曲线上出现了熔融双峰，说明纳米碳酸钙，庚二酸复合成核剂与单一成核剂相比有明显地促进β晶生成的作用，宽角X射线衍射（WAXD）实验进一步证实了β晶的存在．单一纳米碳酸钙成核剂对PP微孔膜的球晶结构和微观孔结构影响不大；加入纳米碳酸钙，庚二酸复合成核剂明显影响PP微孔膜的球晶结构和微观孔结构，其中0．5％庚二酸和1％纳米碳酸钙组成的复合成核剂制得的PP微孔膜的球晶结构明显，微孔膜孔径小且分布均匀；进一步增加纳米碳酸钙用量，PP微孔膜生成了许多细小的边界模糊的不规则结晶，微孔膜孔径不规则且尺寸较大，这与此时PP形成β晶结构有关．

关键词：纳米碳酸钙庚二酸成核剂热致相分离法聚丙烯微孔膜

PP/庚二酸表面处理云母复合材料的力学性能和结晶行为

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中国塑料 2007年第8期21卷 24-28页

作者：孟明锐窦强南京工业大学材料科学与工程学院高分子系江苏南京210009

采用庚二酸表面处理云母填充改性 PP,研究了复合材料的力学性能和结晶行为。结果表明,复合材料的拉伸强度和弯曲模量均随云母质量分数的增加而增加,特别是冲击性能得到了明显的提高,当处理过的云母含量为5%(质量分数,下同)时,复合材料... 详细信息

采用庚二酸表面处理云母填充改性 PP,研究了复合材料的力学性能和结晶行为。结果表明,复合材料的拉伸强度和弯曲模量均随云母质量分数的增加而增加,特别是冲击性能得到了明显的提高,当处理过的云母含量为5%(质量分数,下同)时,复合材料的缺口冲击强度达到了32.43 kJ/m^2,是纯 PP 的5.96倍。广角 X 射线衍射仪、差示扫描量热仪和偏光显微镜的分析结果都证明了庚二酸表面处理云母可以诱导产生大量β晶,这是复合材料冲击性能改善的原因。

关键词：聚丙烯云母庚二酸 β晶

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庚二酸的研究进展

化工中间体 2007年第11期3卷 16-19页

作者：林晓霖袁斌段博广东工业大学环境科学与工程学院广东广州510006

庚二酸是制备许多重要化工产品的原料和中间体,广泛应用于功能高分子材料或生物医药研究。综述了庚二酸的性质、用途及合成方法,重点介绍了国内外合成庚二酸的研究进展。

关键词：庚二酸性质合成应用

生物素前体物：庚二酸在重组枯草芽孢杆菌中的高效合成

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生物素前体物：庚二酸在重组枯草芽孢杆菌中的高效合成

作者：李恒鑫西北农林科技大学

学位级别：硕士

生物素（vitamin H）是动物机体维持正常生理机能所必需的B族维生素之一,在畜牧业、食品及医药等领域应用广泛。我国所用的生物素大部分从美国、日本等国家进口,价格昂贵。因此,有必要进行生物素合成的研究。由于化学法生产的高污染性,... 详细信息

生物素（vitamin H）是动物机体维持正常生理机能所必需的B族维生素之一,在畜牧业、食品及医药等领域应用广泛。我国所用的生物素大部分从美国、日本等国家进口,价格昂贵。因此,有必要进行生物素合成的研究。由于化学法生产的高污染性,利用微生物发酵生产生物素成为国际上高技术竞争的又一热点。而枯草芽孢杆菌作为一种优秀的基因工程菌成为生产生物素的首选。庚二酸是枯草芽孢杆菌生物素合成前体物之一,在发酵生产过程中通常被添加到发酵液中来提高生物素产量,但其高价格和添加带来的环境污染问题限制了它的应用,成为发酵生产生物素过程中一个亟待解决的问题。通过基因重组来提高枯草芽孢杆菌自身庚二酸的产量就成了解决这个难题的唯一出路。在庚二酸合成基因方面人们做了大量的研究,现一致认为在枯草芽孢杆菌生物素操纵子中的bioI-orf2顺反子序列与庚二酸合成密切相关。而orf3这个功能未知基因与该顺反子紧密相连,推测可能与庚二酸和生物素的转运有关。影响克隆基因表达效率的因素有2个:第一是启动子强度;第二是基因拷贝数,但由于克隆质粒在枯草芽孢杆菌中存在复制不稳定及表达外源基因效率低等现象,将外源目的基因整合到染色体上复制表达成为解决这些问题的有效策略。本研究以枯草芽孢杆菌PY79菌株为研究材料,将强麦芽糖启动子Pglv及氯霉素基因连接到bioI-orf2-orf3顺反子上游,然后通过同源重组整合到枯草芽孢杆菌染色体上。通过增加整合序列的拷贝数,最终增加庚二酸合成量。设计引物Cm-up/Cm-down和Cobio1-up/Cobio2-down,分别以质粒pGJ103和枯草芽孢杆菌168基因组DNA为模板,PCR扩增氯霉素基因（~1.0 kbp）和bioI-orf2-orf3顺反子序列（~2.8 kbp）,纯化的PCR产物分别克隆入pGEM-T和pBluskm载体中产生质粒pLHX1和pLHX2。然后将pLHX2中的EcoRI-XbaI限制性内切酶片段（bioI-orf2-orf3,2.8 kbp）与pGJ113中的ApaI-EcoRI片段（Pglv,300 bp）相连接并克隆入pGEM-T载体中相应的酶切位点,产生pYG57。将pLHX1中氯霉素基因片段连入pE3载体中产生pLHX5。最后将pYG57中XbaI-ApaI片段（Pglv-bioI-orf2-orf3）插入pLHX5中产生整合载体pLHX8。所有的连接产物都以电转化转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中扩增。由于pLHX8中的bioI-orf2-orf3序列与枯草芽孢杆菌PY79基因组生物素操纵子序列同源,通过单交叉整合方式将pLHX8滚环式带入PY79染色体,形成BpLHX8。PCR初筛,正确整合子通过高氯霉素抗性（50μg/ml）扩增整合序列拷贝数,通过Southern blotting可检测到4~5个拷贝数。通过反相高效液相色谱法测定了发酵液体中庚二酸和生物素的的含量。试验结果表明,将Pglv-bioI-orf2-orf3顺反子序列整合到宿主菌染色体,通过氯霉素抗性提高整合序列拷贝数以及麦芽糖诱导表达,提高了庚二酸基因的合成效率,验证了bioI-orf2-orf3顺反子序列在庚二酸合成中的重要作用。在庚二酸合成量提高的同时降低生产成本,生物素的产量也得到提高,为生物素的发酵生产建立了可行的研究路线和理论依据。

关键词：枯草芽孢杆菌庚二酸生物素 bioI-orf2-or3 整合

生物素含量测定的RP-HPLC法的建立及添加外源庚二酸对生物素产量的影响

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生物素含量测定的RP-HPLC法的建立及添加外源庚二酸对生物素产量...

作者：蒲跃进西北农林科技大学

学位级别：硕士

生物素是动物生长过程中一种必需的维生素,对动物的正常生长、繁殖、饲料利用以及皮肤、骨骼、羽毛的生长发育都起到重要作用。但到目前为止,生物素的生产主要依赖于化学合成方法。由于化学合成方法存在着工艺复杂、成本高、易污染等缺... 详细信息

生物素是动物生长过程中一种必需的维生素,对动物的正常生长、繁殖、饲料利用以及皮肤、骨骼、羽毛的生长发育都起到重要作用。但到目前为止,生物素的生产主要依赖于化学合成方法。由于化学合成方法存在着工艺复杂、成本高、易污染等缺点,因此科学家试图利用微生物来大量合成生物素。大量试验已经证明:枯草杆菌、真菌等微生物可以合成生物素,而且生产成本低,能够适应工业化生产。本研究借鉴前人的先进经验和技术,选择能够有效合成生物素的枯草芽孢杆菌BQJ-34作为生物工程菌,并通过调整菌种生长必需的碳源和合成生物素前体物质庚二酸来加快细菌生长繁殖,以最大限度地提高生物素产量。利用生物素培养基对菌株BQJ-34进行振荡培养,取48h的细菌培养液10ml置100℃条件下水浴1 h,随后在超速离心机上以10 000 r/min,30 min离心,取上清液用0.22μm滤膜过滤,用高效液相检测滤液中的生物素含量,并通过对生物素样品的回归分析和回收率、精密度试验,最终确定利用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)可用于培养液中生物素测定,其最佳检测条件是:用安捷伦Zorbax SB-C18(4.6250cm,5μm)色谱柱,以KHPO(0.04mol,pH2.5)和CHCN(二者体积比为91.5:8.5)为流动相,紫外检测波长为215nm。为了确定生物素培养基中最佳麦芽糖添加量,将培养基分成6组,分别加入0%,2%,4%,6%,8%,10%的麦芽糖,接种菌种,在37℃,220r/min条件下进行振荡培养。通过测定24、48和72h培养液中残糖量和菌液吸收值,观察菌株生长状态,经进一步筛选,确定该培养液中的麦芽糖最适添加量为5%。用于庚二酸测定的培养液首先以10 000 r/min离心30 min,取上清液,用0.02μm滤膜过滤,然后用高效液相色谱法测定滤液中的庚二酸含量,确定其最佳检测条件为:用安捷伦Zorbax SB-C18(4.6250cm,5μm)色谱柱,以K2HPO4(0.02mol, Ph3.0)和CH3OH(二者体积比为90:10)为流动相,紫外检测波长为218nm。本研究还将添加5%的麦芽糖的生物素培养基分组,分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0g/L的庚二酸,接种,在37℃,220r/min条件下进行振荡培养,然后测定24、48和72h时菌液的吸收值、pH值、生物素和庚二酸含量,确定庚二酸添加量为1.0g/L时,培养液中的生物素产量最大,庚二酸利用率最高。

关键词：生物素麦芽糖庚二酸高效液相色谱