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抗新型冠状病毒中和抗体研究现状及展望

中国科学基金 2022年第4期36卷 624-629页

作者：鞠斌周兵张政深圳市第三人民医院肝病研究所南方科技大学第二附属医院

中和抗体是一种卓越的抗病毒“特效药”,在对抗新型冠状病毒肺炎疫情中被寄予厚望，然而新冠病毒变异株不断出现，完全或者部分逃逸了中和抗体，显著降低了中和抗体的抗病毒作用。本文综述了当前新冠中和抗体的研发现状，重点阐明了这... 详细信息

中和抗体是一种卓越的抗病毒“特效药”,在对抗新型冠状病毒肺炎疫情中被寄予厚望，然而新冠病毒变异株不断出现，完全或者部分逃逸了中和抗体，显著降低了中和抗体的抗病毒作用。本文综述了当前新冠中和抗体的研发现状，重点阐明了这些抗体的作用靶点、机制以及分类特征等；并在新冠病毒变异株全球大流行的背景下，探讨中和抗体面临的严峻挑战和未来可能的发展方向，旨在为研发更加广谱中和抗体对抗病毒突变提供重要思路。

关键词：新型冠状病毒中和抗体受体结合区域 ACE2受体病毒突变免疫逃逸广谱中和抗体

以流感病毒血凝素为靶标的抗病毒防治策略研究进展

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中华微生物学和免疫学杂志 2023年第11期43卷 850-859页

作者：蔡铭李雪丹邵亮彭飞霞张哲罡刘博年悬悬张家友曹慧杨晓明武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究二室武汉430207 西安交通大学基础医学院西安710061 国家联合疫苗工程技术研究中心科研开发部武汉430075 北京生物制品研究所有限责任公司质量保证部北京101100 中国生物技术股份有限责任公司北京100024

流感是由流感病毒引起的一种在全球范围内流行的传染病,从1918年追溯至今,已给公共健康和社会稳定带来了巨大的冲击。目前,接种流感疫苗是预防和控制流感流行的最有效方式。近几年,对广谱抗病毒药物和中和抗体的研究不断深入。流感病毒... 详细信息

流感是由流感病毒引起的一种在全球范围内流行的传染病,从1918年追溯至今,已给公共健康和社会稳定带来了巨大的冲击。目前,接种流感疫苗是预防和控制流感流行的最有效方式。近几年,对广谱抗病毒药物和中和抗体的研究不断深入。流感病毒表面血凝素在病毒侵入宿主细胞阶段发挥重要作用,是现有流感疫苗的主要有效抗原成分,也是广谱中和抗体、广谱抗病毒药物的主要靶标。本文就近年来基于流感病毒血凝素的新型流感疫苗、中和抗体以及抗病毒药物等防治策略的研究进展进行综述,为后续流感的预防和控制提供新的思路。

关键词：流感病毒血凝素流感疫苗广谱中和抗体抗病毒药物

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人免疫缺陷病毒广谱中和抗体的研究进展

中国生物制品学杂志 2023年第2期36卷 217-223,234页

作者：张慧邓婷婷(综述) 李少伟顾颖(审校) 厦门大学公共卫生学院分子疫苗学与分子诊断学国家重点实验室福建厦门361102 厦门大学生命科学学院国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心福建厦门361102

艾滋病(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)是全球性公共卫生问题,对人类生命健康造成了重大影响。人免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type-1,HIV-1)是AIDS的主要致病原,具有高变异性和潜伏性,因此缺乏有效的疫... 详细信息

艾滋病(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)是全球性公共卫生问题,对人类生命健康造成了重大影响。人免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type-1,HIV-1)是AIDS的主要致病原,具有高变异性和潜伏性,因此缺乏有效的疫苗和药物进行AIDS的预防及治疗。HIV-1广谱中和抗体(broadly neutralizing antibodies,bNAbs)在机体内可针对HIV-1感染产生有效的免疫应答,可同时中和不同型别毒株,在预防HIV-1感染及控制AIDS进程中具有巨大应用潜力。本文就HIV-1 bNAbs的产生及获得、分类及特点、应用情况作一综述,以期为后续HIV-1疫苗研究和抗体药物开发提供参考。

关键词：人免疫缺陷病毒广谱中和抗体艾滋病

HIV-1流行株囊膜假病毒系统的构建及广谱中和抗体中和效价的测定

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病毒学报 2023年第5期39卷 1314-1325页

作者：高阳江昊王茂林王永腾王涛田昊马妍吕启航谢婷雨孙瑜张晓龙孙健红顾潮江武汉科技大学生命科学与健康学院武汉430065 武汉科技大学计算机科学与技术学院武汉430065

人类免疫缺陷病毒主要感染人CD4+T细胞与单核-巨噬细胞,造成高致命性的免疫系统衰竭。近年来,抗HIV-1的广谱中和抗体被用于HIV-1感染的阻断和临床免疫治疗效果显著。然而,针对HIV-1抗体中和活性评价假病毒谱系仍有待补充,本研究旨在构... 详细信息

人类免疫缺陷病毒主要感染人CD4+T细胞与单核-巨噬细胞,造成高致命性的免疫系统衰竭。近年来,抗HIV-1的广谱中和抗体被用于HIV-1感染的阻断和临床免疫治疗效果显著。然而,针对HIV-1抗体中和活性评价假病毒谱系仍有待补充,本研究旨在构建一种易于量化,生物安全性高的HIV-1流行毒株假病毒谱系,用于定量HIV-1中和抗体抗病毒活力。研究从10种亚型中选取了24株代表性HIV-1国内外流行毒株,构建囊膜表达质粒并与囊膜缺失骨架质粒pNL4-3-copGFP-ΔENV共转染制备慢病毒。通过定量p24抗原和测定TCID50分别获得病毒物理和活性滴度。以本实验室表达、纯化的HIV广谱中和抗体VRC01、3BNC117和N6经多梯度稀释后,分别与200 TCID50的假病毒孵育后,感染敏感指示细胞TZM-bl。随后通过测定荧光素酶活性定量假病毒的感染水平并计算出抗体的中和活性。结果表明:三种广谱中和抗体均能中和24种假病毒并计算获得了IC50。本研究成功建立了24种假病毒,可为HIV的抗体筛选功能验证和疫苗免疫效果提供中和活性评价平台。

关键词： HIV-l假病毒 TZM-bl TCID50 广谱中和抗体

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SARS-CoV-2广谱中和抗体性质鉴定

中国免疫学杂志 2024年第4期40卷 693-697页

作者：陈秀婷汪毅祯商慧娴王思令郑子峥厦门大学分子疫苗学与分子诊断学国家重点实验室厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心厦门大学公共卫生学院厦门361102

目的:对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)广谱中和抗体XMA09进行性质鉴定,探究其广谱中和突变株的潜在机制,为SARS-CoV-2的疫苗设计与广谱中和抗体筛选提供参考。方法:通过ExpiCHO真核表达系统与Protein A层析柱表达纯化XMA09蛋... 详细信息

目的:对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)广谱中和抗体XMA09进行性质鉴定,探究其广谱中和突变株的潜在机制,为SARS-CoV-2的疫苗设计与广谱中和抗体筛选提供参考。方法:通过ExpiCHO真核表达系统与Protein A层析柱表达纯化XMA09蛋白;冷冻电镜技术确定XMA09识别的受体结构域(RBD)上的关键氨基酸位点;间接ELISA与表面等离子共振(SPR)技术检测XMA09对SARS-CoV-2及其突变株Spike蛋白的亲和力;采用基于水疱性口炎病毒(VSV)的假病毒系统检测XMA09对SARS-CoV-2野生型及突变株的中和能力。结果:本研究发现XMA09识别的表位较为保守,对多种突变株Spike蛋白均具有强结合能力,能广谱中和关切突变株(VOCs),包括广泛流行的Omicron亚突变株BA.4/5。结论:XMA09是SARS-CoV-2广谱中和抗体,具有作为SARS-CoV-2治疗性抗体的潜力,并可为SARS-CoV-2的广谱疫苗设计与抗体药物开发提供参考意义。

关键词： SARS-CoV-2 受体结合结构域(RBD) 广谱中和抗体

嵌合广谱中和抗体VRC01、N6、3BNC117的外泌体抗HIV感染研究

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嵌合广谱中和抗体VRC01、N6、3BNC117的外泌体抗HIV感染研究

作者：吕启航武汉科技大学

学位级别：硕士

背景及目的:目前,艾滋病(AIDS)仍是一种对人类健康安全有重大威胁的传染病,利用现有药物不能对其彻底治愈且无有效疫苗。高效抗逆转录病毒疗法(HAART)是目前治疗采用的主要方法,该疗法通过把蛋白酶抑制剂与多种抗病毒的药物联合起来进... 详细信息

背景及目的:目前,艾滋病(AIDS)仍是一种对人类健康安全有重大威胁的传染病,利用现有药物不能对其彻底治愈且无有效疫苗。高效抗逆转录病毒疗法(HAART)是目前治疗采用的主要方法,该疗法通过把蛋白酶抑制剂与多种抗病毒的药物联合起来进行给药治疗,可以最大限度地抑制病毒的复制,但由于不能清除CD4T细胞中的HIV-1潜伏病毒库,因此患者需要终身服药。近年来研究者从HIV-1精英患者体内分离到了多个广谱中和抗体(broadly neutralizing antibody,b NAb),包括VRC01、N6、3BNC117等,这些b NAbs可以中和98%的HIV-1毒株,使用抗HIV-1 b NAbs的免疫疗法在抑制病毒感染的同时,可以提高感染细胞的清除率,且在动物实验和人体临床研究中被证明具有预防和治疗AIDS的作用,是功能性治愈AIDS最主要治疗方向。目前已有的b NAbs如VRC01、N6、3BNC117是通过结合HIV-1囊膜的gp120蛋白来捕获病毒,进而发挥抗HIV-1感染及清除病毒及其感染细胞的作用。外泌体(Exosome,EXO)是一种细胞来源的天然囊泡,它主要形成过程是通过质膜凹陷形成分选内涵体,然后形成多囊泡体,最后多囊泡体与质膜融合将其分泌到细胞外。EXO具有良好的生物相容性、非免疫原性和高稳定性,可以透过包括血脑屏障在内的绝大多数生物屏障系统,且外泌体膜修饰方式多样,因此其本身或作为载体正在被积极研究。本研究通过HEK 293F细胞表达VRC01、N6、3BNC117并加载跨膜区使b NAb嵌合在外泌体膜上,能够以外泌体为介导发挥b NAb的抗HIV-1感染作用。方法:在成功构建的HEK 293F蛋白表达系统的基础上,构建VRC01、N6和3BNC117表达质粒,并通过HEK 293F蛋白表达系统表达VRC01、N6和3BNC117,收集其细胞培养上清,利用超速离心法分离提取EXO。利用透射电子显微镜(TEM)、纳米粒子示踪分析技术(NTA)、蛋白免疫印迹(WB)、外泌体流式细胞术对其进行分析和鉴定。再通过加载CD28跨膜区氨基酸的基因编码序列(CD28 TM)、HIV-1囊膜蛋白跨膜区氨基酸的基因编码序列(HIV-1 TM)、VSV-G囊膜蛋白跨膜区氨基酸的基因编码序列(VSV-G TM)、EBOV囊膜蛋白跨膜区氨基酸的基因编码序列(EBOV TM)、Marburg囊膜蛋白跨膜区氨基酸的基因编码序列(Marburg TM)到VRC01重链表达质粒上,并筛选出使b NAb更多地嵌合在EXO上的跨膜区。将嵌合广谱中和抗体的外泌体与染料标记的抗人Ig G Fc段的流式抗体、抗人Ig G Fab段的流式抗体以及染料标记的HIV-1 gp120三聚体蛋白孵育结合后,通过流式细胞术分析,以此来探究b NAbs在EXO上的展示方式。最后通过嵌合b NAbs的EXO(EXO-b NAbs)与HIV-1的体外中和实验,验证EXO-b NAbs抗HIV-1感染的能力。结果:本研究成功利用超速离心法分离提取到EXO-b NAbs,并通过验证其标记蛋白和抗体蛋白,首次发现在HEK 293F蛋白表达系统成功表达VRC01时,会产生EXO-b NAbs。通过加载并比较五种不同跨膜区对EXO-b NAbs中和活力的影响,筛选出CD28 TM,它可以使更多的b NAb嵌合到EXO上。通过外泌体流式细胞术分析探究b NAbs在EXO上的展示方式,证明b NAb的Fab、Fd、Fc均展示在EXO膜外,其中Fc段在EXO是100%暴露。与HIV-1毒株NL4-TAA的体外中和实验验证了这种EXO-b NAbs具有中和活力,并发挥抗HIV-1感染的作用。结论:综上所述,本研究通过对分离提取的EXO进行分析鉴定,确定了超速离心分离提取EXO的方法。得到了HEK 293F细胞来源的EXO-b NAbs,并通过外泌体流式细胞术验证了b NAb的Fab、Fd、Fc嵌合在EXO膜外,其中Fc 100%暴露在EXO外。与NL-4 TAA的中和实验结果表明,这种EXO-b NAbs具有较好的抗HIV-1感染的能力。以上结论对于针对AIDS的抗体免疫疗法的优化提供了新的方向。

关键词：抗HIV-1感染广谱中和抗体外泌体中和活性

抗SARS-CoV-2与SARS-CoV广谱中和抗体筛选及功能验证

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抗SARS-CoV-2与SARS-CoV广谱中和抗体筛选及功能验证

作者：罗玲安徽农业大学

学位级别：硕士

冠状病毒是一类包膜RNA病毒,目前有7种冠状病毒是能够感染人类的,其中3种具有高致病性,4种具有低致病性。严重急性呼吸综合症冠状病毒-2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)和严重急性呼吸综合征冠状病毒(Sev... 详细信息

冠状病毒是一类包膜RNA病毒,目前有7种冠状病毒是能够感染人类的,其中3种具有高致病性,4种具有低致病性。严重急性呼吸综合症冠状病毒-2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)和严重急性呼吸综合征冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus,SARS-CoV)均为β冠状病毒属的两种高致病性冠状病毒,二者的基因组序列相似性约为80%,两种病毒均通过结合细胞表面的血管紧张素转化酶II(ACE2)进入细胞。SARS-CoV-2致死率(3%)低于SARS-CoV(10%),但具有极强的传染性。截止2023年2月10日,据WHO统计,全球累计SARS-CoV-2确诊病例已超6亿例,死亡病例超683万例。为此,针对该病毒的疫苗开发和中和抗体类药物的生产等备受关注,并且目前已有多种获批紧急使用或上市的疫苗和中和抗体药物。然而SARS-CoV-2 Omicron病毒株对目前积极使用的中和抗体药物可产生极强的免疫逃逸,并且这些中和抗体不能中和SARS-CoV。因此,筛选出中和SARS-CoV-2和SARS-CoV的广谱中和抗体对防控类似SARS-CoV-2和SARS-CoV等的β冠状病毒感染具有重要应用价值。本研究主要以SARS-CoV-2和SARS-CoV广谱性中和性抗体的筛选为目标,为后续广谱类中和抗体药物的开发提供一些思路。为此,我们制备了以SARS-CoV-2RBD为免疫原的m RNA疫苗对小鼠进行免疫,并诱导大量抗原特异性抗体的产生,再通过高通量单细胞测序技术构建出SARS-CoV-2特异性抗体库,从抗体库中我们合成并表达了出现频率最高的前100株单克隆抗体,通过基因座分析、结合效应分析、亲和力测定、中和活性评价以及阻断效应评价等方法,完成了抗SARS-CoV-2和SARS-CoV广谱中和抗体筛选的一系列工作。研究结果显示,利用SARS-CoV-2 RBD m RNA疫苗免疫可以快速诱导抗原特异性的抗体库产生,且该抗体库在基因座的使用上具有一定的聚焦性。我们从抗体库中选取了100株抗体进行基因合成并表达,从中我们筛选到能特异性结合SARS-CoV-2RBD的抗体有65株,能结合SARS-CoV-2 RBD和SARS-CoV RBD的抗体有8株。从这8株抗体中,我们筛选出2株能中和SARS-CoV-2和SARS-CoV的广谱中和抗体,分别为R30和R100抗体。其中,R30抗体可完全阻断两种病毒RBD蛋白与受体结合,R100抗体可完全阻断SARS-CoV-2 RBD与受体结合,可部分阻断SARSCoV RBD与受体结合。经过抗体表位竞争实验初步分析出R100中和抗体的结合表位可能与I类抗体的结合位点有很大重合,而R30中和抗体可能靶向于一个新的抗原表位。此外,我们还从这8株抗体中筛选到了包括R30和R100抗体在内的5株广谱中和SARS-CoV-2及其Delta变异株和Beta变异株的中和抗体,且均能够完全阻断SARS-CoV-2 RBD与受体结合。综上,本研究中利用高通量单细胞测序技术成功完成了SARS-CoV-2特异性抗体库的建库及测序工作,且通过这种大规模的筛选方式可筛选到2株中和SARS-CoV-2和SARS-CoV广谱中和抗体,尽管这两株抗体的中和活性不强,但后续通过抗体工程技术对其进行改造以及对其中和机制的深入研究将对未来广谱类疫苗及中和抗体的开发提供一些新的研究方向。

关键词： SARS-CoV-2 SARS-CoV B细胞抗体库广谱中和抗体

全人源广谱中和抗体靶向中国HIV-1流行株gp120的亲和力及中和活力研究

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全人源广谱中和抗体靶向中国HIV-1流行株gp120的亲和力及中和活力...

作者：孙瑜武汉科技大学

学位级别：硕士

背景:虽然高效抗逆转录病毒治疗（HAART）在控制HIV-1感染方面卓有成效,但存在服药依从性差、耐药等诸多问题。近年来,HIV-1的抗体治疗成为热点,抗HIV-1广谱中和抗体（b NAbs）通过与HIV-1包膜糖蛋白gp120特异性结合可以中和HIV-1、预防... 详细信息

背景:虽然高效抗逆转录病毒治疗（HAART）在控制HIV-1感染方面卓有成效,但存在服药依从性差、耐药等诸多问题。近年来,HIV-1的抗体治疗成为热点,抗HIV-1广谱中和抗体（b NAbs）通过与HIV-1包膜糖蛋白gp120特异性结合可以中和HIV-1、预防HIV-1感染,在艾滋病功能性治愈乃至根治上极有可能发挥重要作用,带来颠覆性的突破。而我国HIV-1感染情况复杂多变,目前,尚无针对国内HIV-1流行毒株的快速、可靠的b NAbs筛选方法及亲和力和中和活性探究。本研究旨在通过分子对接的方法,快速筛选出可能与国内HIV-1优势流行株具有较好亲和力的b NAbs,并进一步检测其亲和力及中和能力。期望为针对中国HIV-1亚型的抗体治疗和CAR-T治疗提供重要指南,并作为HIV-1功能性治愈免疫治疗策略的设计参考。方法:利用分子对接,筛选出可能与中国流行的HIV-1gp120具有高亲和力的b NAbs。构建、表达、纯化了四种在中国流行的HIV-1亚型gp120,同时,在优化条件下,将b NAbs克隆并瞬时表达于293F细胞中并进行纯化。利用BLI测定两者亲和力大小;并进一步构建、包装了HIV-1假病毒,测定b NAbs中和活性。结果:本研究成功从已发现的b NAbs中筛选出了对国内流行HIV-1亚型具有高亲和力的靶向gp120的b NAbs:VRC01抗体、N6抗体、3BNC117抗体;构建了3种抗体的表达质粒及4种gp120表达质粒,并成功优化了抗体表达,实现抗体产量的最大化,获得纯度＞95%的抗体和gp120蛋白,并实验验证了这3种抗体对国内流行HIV-1亚型具有较高的亲和力和中和活性。结论:综上所述,本研究以分子对接的方法筛选出了对国内HIV-1具有较好对接得分的b NAbs,并通过实验评价其亲和力及中和活性。结果显示筛选出的3种b NAbs对4种国内HIV-1流行毒株均具有较好的亲和力和广谱中和活性,其中,N6的中和效果最好。这一发现为课题组后续进行被动免疫治疗和CAR-T治疗时对b NAbs的选择提供了参考,也为HIV-1疫苗的研发提供了新思路。利用分子对接来筛选b NAbs还为抗体药研发提供了新方法。

关键词： HIV包膜糖蛋白广谱中和抗体分子对接生物层干涉技术中和活性

HIV-1中和抗体的分选和鉴定及其重组IgM型抗体的改造

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HIV-1中和抗体的分选和鉴定及其重组IgM型抗体的改造

作者：万鑫蕊昆明医科大学

学位级别：硕士

[目的]本研究以我国HIV-1感染的长期不进展者为研究样本,从中分选靶向HIV-1的中和抗体并分析其可变区序列特征和功能活性。随后通过基因工程技术将分选的中和抗体改造为IgM形式。了解改造后的IgM抗体亲和力和中和活性的改变。探索IgM... 详细信息

[目的]本研究以我国HIV-1感染的长期不进展者为研究样本,从中分选靶向HIV-1的中和抗体并分析其可变区序列特征和功能活性。随后通过基因工程技术将分选的中和抗体改造为IgM形式。了解改造后的IgM抗体亲和力和中和活性的改变。探索IgM类抗体在HIV-1被动免疫治疗领域中的应用价值和范围。为诱导保护性IgM抗体为目标的疫苗提供一定的理论基础,为艾滋病的防治提供新的思路。[方法]（1）采用单个记忆B细胞流式分选的方法,进行HIV-1特异性中和抗体的分选和特征鉴定。针对候选样本分选得到的HIV-1特异性单个记忆B细胞进行逆转录PCR、巢式PCR扩增抗体轻、重链可变区的基因序列并插入到表达载体中。挑选基因序列具有特征的抗体在293T和293F细胞中进行表达,采用重组protein A进行纯化。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）和酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）初步鉴定其分子量大小和结合功能。（2）选择具有一定结合活性的抗体将其改造为IgM形式,在293T和CHO-S细胞中进行表达,采用IgM focurose 6HP层析柱进行纯化。通过微量热涌动（Microscale thermophoresis,MST）实验和中和实验检测同一抗体IgG和IgM形式亲和力大小和中和活性的差异。[结果]（1）分选得到单个记忆B细胞,并扩增获得98对抗体基因序列。其中重链来源于4个胚系基因,分别为IGHV1-2、IGHV1-69、IGHV3-30和 IGHV3-15,体细胞高频突变（somatic hypermutation,SHM）水平为 2.4%-32.4%。轻链来源于4个胚系基因,分别为IGLV3-19、IGLV1-44、IGKV1-5和IGKV3-11,SHM水平为3.6%-27.9%。（2）4个分选抗体在293T细胞上清中分泌表达,分别为2C5、2E8、3C10和3D9。（3）SHM水平相对较高的2E8抗体在293F细胞上清中表达并纯化。ELISA初步鉴定其抗原结合能力并与本课题组前期分选抗体7D5相比,7D5的结合能力强于2E8。（4）对2E8和7D5进行IgM改造,构建IgM表达质粒。并在293T细胞中成功表达。（5）IgM-2E8和IgM-7D5在CHO-S细胞培养上清中表达并纯化。（6）对同一抗体的IgG和IgM形式的亲和力进行比较。IgM-2E8亲和力有近10倍的提升,而IgM-7D5的亲和力也有近两倍的提升。（7）对同一抗体的IgG和IgM形式的中和活性进行比较,IgM-2E8和IgM-7D5对HIV-1假病毒398F1和246F3的中和活性均有近2倍的提升。[结论]分选获得了靶向HIV-1的中和抗体,对其序列特征分析提示高水平的体细胞超突变可能会影响抗体的亲和力和中和活性。IgM改造后的中和抗体不仅提高了抗体的亲和力,同时间接提高了抗体的中和活性,为HIV-1的预防和疫苗开发提供更多的策略。

关键词： HIV-1 广谱中和抗体免疫球蛋白M 亲和力