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人类免疫缺陷病毒1型的广谱中和抗体的亲和力成熟与特征及其运用

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中华预防医学杂志 2022年第2期56卷 225-232页

作者：万鑫蕊孙明李娅昆明医科大学第一附属医院医学检验科云南省检验医学重点实验室昆明医科大学第一附属医院临床检验诊断省创新团队昆明650032 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所昆明650118

人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染的长期不进展者(LTNP)体内分离到的广谱中和抗体(bNAbs),已被证明可以预防HIV-1感染并降低感染者体内的病毒载量,成为了指导HIV-1疫苗设计和被动免疫治疗的突破口。中和抗体的功能除了与靶向表位有关,其... 详细信息

人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染的长期不进展者(LTNP)体内分离到的广谱中和抗体(bNAbs),已被证明可以预防HIV-1感染并降低感染者体内的病毒载量,成为了指导HIV-1疫苗设计和被动免疫治疗的突破口。中和抗体的功能除了与靶向表位有关,其亲和力也极大的影响了抗体的活性。HIV-1 bNAbs通过体内的多轮亲和力成熟获得了较高亲和力,从而实现了广谱度和中和活性的增加。高亲和力HIV-1 bNAbs在治疗过程中能更好的协助机体免疫系统清除病原体,并且使用剂量更少,毒副作用也相对较低。在亲和力成熟的同时,HIV-1 bNAbs表现出了高水平的体细胞超突变(SHM)、插入缺失、较长的重链第三互补决定区等不寻常的特征。这些特征阻碍了通过有效疫苗诱导HIV-1 bNAbs在体内产生并发育成熟,因此了解抗体亲和力成熟过程中发生的突变及其要点,有助于理解中和抗体的活性与特征的关系,并为设计有效的HIV-1潜在免疫原提供参考。

关键词：人类免疫缺陷病毒广谱中和抗体抗体亲和力疫苗

HIV-1流行株囊膜假病毒系统的构建及广谱中和抗体中和效价的测定

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病毒学报 2023年第5期39卷 1314-1325页

作者：高阳江昊王茂林王永腾王涛田昊马妍吕启航谢婷雨孙瑜张晓龙孙健红顾潮江武汉科技大学生命科学与健康学院武汉430065 武汉科技大学计算机科学与技术学院武汉430065

人类免疫缺陷病毒主要感染人CD4+T细胞与单核-巨噬细胞,造成高致命性的免疫系统衰竭。近年来,抗HIV-1的广谱中和抗体被用于HIV-1感染的阻断和临床免疫治疗效果显著。然而,针对HIV-1抗体中和活性评价假病毒谱系仍有待补充,本研究旨在构... 详细信息

人类免疫缺陷病毒主要感染人CD4+T细胞与单核-巨噬细胞,造成高致命性的免疫系统衰竭。近年来,抗HIV-1的广谱中和抗体被用于HIV-1感染的阻断和临床免疫治疗效果显著。然而,针对HIV-1抗体中和活性评价假病毒谱系仍有待补充,本研究旨在构建一种易于量化,生物安全性高的HIV-1流行毒株假病毒谱系,用于定量HIV-1中和抗体抗病毒活力。研究从10种亚型中选取了24株代表性HIV-1国内外流行毒株,构建囊膜表达质粒并与囊膜缺失骨架质粒pNL4-3-copGFP-ΔENV共转染制备慢病毒。通过定量p24抗原和测定TCID50分别获得病毒物理和活性滴度。以本实验室表达、纯化的HIV广谱中和抗体VRC01、3BNC117和N6经多梯度稀释后,分别与200 TCID50的假病毒孵育后,感染敏感指示细胞TZM-bl。随后通过测定荧光素酶活性定量假病毒的感染水平并计算出抗体的中和活性。结果表明:三种广谱中和抗体均能中和24种假病毒并计算获得了IC50。本研究成功建立了24种假病毒,可为HIV的抗体筛选功能验证和疫苗免疫效果提供中和活性评价平台。

关键词： HIV-l假病毒 TZM-bl TCID50 广谱中和抗体

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SARS-CoV-2广谱中和抗体性质鉴定

中国免疫学杂志 2024年第4期40卷 693-697页

作者：陈秀婷汪毅祯商慧娴王思令郑子峥厦门大学分子疫苗学与分子诊断学国家重点实验室厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心厦门大学公共卫生学院厦门361102

目的:对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)广谱中和抗体XMA09进行性质鉴定,探究其广谱中和突变株的潜在机制,为SARS-CoV-2的疫苗设计与广谱中和抗体筛选提供参考。方法:通过ExpiCHO真核表达系统与Protein A层析柱表达纯化XMA09蛋... 详细信息

目的:对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)广谱中和抗体XMA09进行性质鉴定,探究其广谱中和突变株的潜在机制,为SARS-CoV-2的疫苗设计与广谱中和抗体筛选提供参考。方法:通过ExpiCHO真核表达系统与Protein A层析柱表达纯化XMA09蛋白;冷冻电镜技术确定XMA09识别的受体结构域(RBD)上的关键氨基酸位点;间接ELISA与表面等离子共振(SPR)技术检测XMA09对SARS-CoV-2及其突变株Spike蛋白的亲和力;采用基于水疱性口炎病毒(VSV)的假病毒系统检测XMA09对SARS-CoV-2野生型及突变株的中和能力。结果:本研究发现XMA09识别的表位较为保守,对多种突变株Spike蛋白均具有强结合能力,能广谱中和关切突变株(VOCs),包括广泛流行的Omicron亚突变株BA.4/5。结论:XMA09是SARS-CoV-2广谱中和抗体,具有作为SARS-CoV-2治疗性抗体的潜力,并可为SARS-CoV-2的广谱疫苗设计与抗体药物开发提供参考意义。

关键词： SARS-CoV-2 受体结合结构域(RBD) 广谱中和抗体

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HIV广谱中和抗体研究进展

中国比较医学杂志 2021年第10期31卷 107-113页

作者：李哲王卫北京协和医学院比较医学中心中国医学科学院医学实验动物研究所新发再发传染病动物模型研究北京市重点实验室卫健委人类疾病比较医学重点实验室北京100021

HIV病毒在全球广泛流行,导致严重传染性疾病——艾滋病(AIDS),对人类生命健康及社会发展造成严重影响。高效抗逆转录病毒疗法(HAART)虽可抑制HIV病毒复制,但无法清除体内病毒。预防性疫苗是对抗HIV的重要工具,但由于该病毒具有遗传多样... 详细信息

HIV病毒在全球广泛流行,导致严重传染性疾病——艾滋病(AIDS),对人类生命健康及社会发展造成严重影响。高效抗逆转录病毒疗法(HAART)虽可抑制HIV病毒复制,但无法清除体内病毒。预防性疫苗是对抗HIV的重要工具,但由于该病毒具有遗传多样性和强变异性,此类疫苗必需能诱导出有效中和多种HIV病毒株的广谱中和抗体(bNAbs)。针对HIV-1 bNAbs诱导和产生的研究面临许多挑战,需要加强相关方向的科技攻关力度。本文综述了HIV-1 bNAbs生物特征、产生机制、诱导策略等方面的最新进展,希望为后续研究提供基础信息和可能方向。

关键词： HIV-1 广谱中和抗体生物特征产生机制诱导策略

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人免疫缺陷病毒广谱中和抗体的研究进展

中国生物制品学杂志 2023年第2期36卷 217-223,234页

作者：张慧邓婷婷(综述) 李少伟顾颖(审校) 厦门大学公共卫生学院分子疫苗学与分子诊断学国家重点实验室福建厦门361102 厦门大学生命科学学院国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心福建厦门361102

艾滋病(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)是全球性公共卫生问题,对人类生命健康造成了重大影响。人免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type-1,HIV-1)是AIDS的主要致病原,具有高变异性和潜伏性,因此缺乏有效的疫... 详细信息

艾滋病(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)是全球性公共卫生问题,对人类生命健康造成了重大影响。人免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type-1,HIV-1)是AIDS的主要致病原,具有高变异性和潜伏性,因此缺乏有效的疫苗和药物进行AIDS的预防及治疗。HIV-1广谱中和抗体(broadly neutralizing antibodies,bNAbs)在机体内可针对HIV-1感染产生有效的免疫应答,可同时中和不同型别毒株,在预防HIV-1感染及控制AIDS进程中具有巨大应用潜力。本文就HIV-1 bNAbs的产生及获得、分类及特点、应用情况作一综述,以期为后续HIV-1疫苗研究和抗体药物开发提供参考。

关键词：人免疫缺陷病毒广谱中和抗体艾滋病

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HIV-1广谱中和抗体及其临床应用

中国艾滋病性病 2016年第10期22卷 840-843页

作者：李岚张彤杨籽翾计云霞陆小凡吴昊粟斌首都医科大学附属北京佑安医院感染中心北京100069

随着抗原特异性B细胞分选和单细胞抗体克隆技术的应用,从2009年至今,已经获得了上百种艾滋病病毒1型(HIV-1)广谱中和抗体(bNAbs),其中大部分抗体针对不同的病毒株显示出具有更广谱更高效的中和活性。在动物实验中,HIV-1bNAbs被动免疫不... 详细信息

随着抗原特异性B细胞分选和单细胞抗体克隆技术的应用,从2009年至今,已经获得了上百种艾滋病病毒1型(HIV-1)广谱中和抗体(bNAbs),其中大部分抗体针对不同的病毒株显示出具有更广谱更高效的中和活性。在动物实验中,HIV-1bNAbs被动免疫不仅可以抑制病毒感染,减少急性期病毒的潜伏,而且可以延迟或阻止感染者停药后血浆中病毒的反弹,维持抗反转录病毒治疗对病毒的抑制效果。最近bNAbs 3BNC117和VRC01已经应用于Ⅰ期临床人体接种试验研究。文章重点对HIV-1bNAbs的临床试验研究进行综述,这将有利于了解bNAbs在人体临床试验中的安全性和有效性,并为防治策略的制定提供新的思路。

关键词：艾滋病病毒Ⅰ型广谱中和抗体被动免疫临床试验

嵌合广谱中和抗体VRC01、N6、3BNC117的外泌体抗HIV感染研究

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嵌合广谱中和抗体VRC01、N6、3BNC117的外泌体抗HIV感染研究

作者：吕启航武汉科技大学

学位级别：硕士

背景及目的:目前,艾滋病(AIDS)仍是一种对人类健康安全有重大威胁的传染病,利用现有药物不能对其彻底治愈且无有效疫苗。高效抗逆转录病毒疗法(HAART)是目前治疗采用的主要方法,该疗法通过把蛋白酶抑制剂与多种抗病毒的药物联合起来进... 详细信息

背景及目的:目前,艾滋病(AIDS)仍是一种对人类健康安全有重大威胁的传染病,利用现有药物不能对其彻底治愈且无有效疫苗。高效抗逆转录病毒疗法(HAART)是目前治疗采用的主要方法,该疗法通过把蛋白酶抑制剂与多种抗病毒的药物联合起来进行给药治疗,可以最大限度地抑制病毒的复制,但由于不能清除CD4T细胞中的HIV-1潜伏病毒库,因此患者需要终身服药。近年来研究者从HIV-1精英患者体内分离到了多个广谱中和抗体(broadly neutralizing antibody,b NAb),包括VRC01、N6、3BNC117等,这些b NAbs可以中和98%的HIV-1毒株,使用抗HIV-1 b NAbs的免疫疗法在抑制病毒感染的同时,可以提高感染细胞的清除率,且在动物实验和人体临床研究中被证明具有预防和治疗AIDS的作用,是功能性治愈AIDS最主要治疗方向。目前已有的b NAbs如VRC01、N6、3BNC117是通过结合HIV-1囊膜的gp120蛋白来捕获病毒,进而发挥抗HIV-1感染及清除病毒及其感染细胞的作用。外泌体(Exosome,EXO)是一种细胞来源的天然囊泡,它主要形成过程是通过质膜凹陷形成分选内涵体,然后形成多囊泡体,最后多囊泡体与质膜融合将其分泌到细胞外。EXO具有良好的生物相容性、非免疫原性和高稳定性,可以透过包括血脑屏障在内的绝大多数生物屏障系统,且外泌体膜修饰方式多样,因此其本身或作为载体正在被积极研究。本研究通过HEK 293F细胞表达VRC01、N6、3BNC117并加载跨膜区使b NAb嵌合在外泌体膜上,能够以外泌体为介导发挥b NAb的抗HIV-1感染作用。方法:在成功构建的HEK 293F蛋白表达系统的基础上,构建VRC01、N6和3BNC117表达质粒,并通过HEK 293F蛋白表达系统表达VRC01、N6和3BNC117,收集其细胞培养上清,利用超速离心法分离提取EXO。利用透射电子显微镜(TEM)、纳米粒子示踪分析技术(NTA)、蛋白免疫印迹(WB)、外泌体流式细胞术对其进行分析和鉴定。再通过加载CD28跨膜区氨基酸的基因编码序列(CD28 TM)、HIV-1囊膜蛋白跨膜区氨基酸的基因编码序列(HIV-1 TM)、VSV-G囊膜蛋白跨膜区氨基酸的基因编码序列(VSV-G TM)、EBOV囊膜蛋白跨膜区氨基酸的基因编码序列(EBOV TM)、Marburg囊膜蛋白跨膜区氨基酸的基因编码序列(Marburg TM)到VRC01重链表达质粒上,并筛选出使b NAb更多地嵌合在EXO上的跨膜区。将嵌合广谱中和抗体的外泌体与染料标记的抗人Ig G Fc段的流式抗体、抗人Ig G Fab段的流式抗体以及染料标记的HIV-1 gp120三聚体蛋白孵育结合后,通过流式细胞术分析,以此来探究b NAbs在EXO上的展示方式。最后通过嵌合b NAbs的EXO(EXO-b NAbs)与HIV-1的体外中和实验,验证EXO-b NAbs抗HIV-1感染的能力。结果:本研究成功利用超速离心法分离提取到EXO-b NAbs,并通过验证其标记蛋白和抗体蛋白,首次发现在HEK 293F蛋白表达系统成功表达VRC01时,会产生EXO-b NAbs。通过加载并比较五种不同跨膜区对EXO-b NAbs中和活力的影响,筛选出CD28 TM,它可以使更多的b NAb嵌合到EXO上。通过外泌体流式细胞术分析探究b NAbs在EXO上的展示方式,证明b NAb的Fab、Fd、Fc均展示在EXO膜外,其中Fc段在EXO是100%暴露。与HIV-1毒株NL4-TAA的体外中和实验验证了这种EXO-b NAbs具有中和活力,并发挥抗HIV-1感染的作用。结论:综上所述,本研究通过对分离提取的EXO进行分析鉴定,确定了超速离心分离提取EXO的方法。得到了HEK 293F细胞来源的EXO-b NAbs,并通过外泌体流式细胞术验证了b NAb的Fab、Fd、Fc嵌合在EXO膜外,其中Fc 100%暴露在EXO外。与NL-4 TAA的中和实验结果表明,这种EXO-b NAbs具有较好的抗HIV-1感染的能力。以上结论对于针对AIDS的抗体免疫疗法的优化提供了新的方向。

关键词：抗HIV-1感染广谱中和抗体外泌体中和活性

抗SARS-CoV-2与SARS-CoV广谱中和抗体筛选及功能验证

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抗SARS-CoV-2与SARS-CoV广谱中和抗体筛选及功能验证

作者：罗玲安徽农业大学

学位级别：硕士

冠状病毒是一类包膜RNA病毒,目前有7种冠状病毒是能够感染人类的,其中3种具有高致病性,4种具有低致病性。严重急性呼吸综合症冠状病毒-2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)和严重急性呼吸综合征冠状病毒(Sev... 详细信息

冠状病毒是一类包膜RNA病毒,目前有7种冠状病毒是能够感染人类的,其中3种具有高致病性,4种具有低致病性。严重急性呼吸综合症冠状病毒-2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)和严重急性呼吸综合征冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus,SARS-CoV)均为β冠状病毒属的两种高致病性冠状病毒,二者的基因组序列相似性约为80%,两种病毒均通过结合细胞表面的血管紧张素转化酶II(ACE2)进入细胞。SARS-CoV-2致死率(3%)低于SARS-CoV(10%),但具有极强的传染性。截止2023年2月10日,据WHO统计,全球累计SARS-CoV-2确诊病例已超6亿例,死亡病例超683万例。为此,针对该病毒的疫苗开发和中和抗体类药物的生产等备受关注,并且目前已有多种获批紧急使用或上市的疫苗和中和抗体药物。然而SARS-CoV-2 Omicron病毒株对目前积极使用的中和抗体药物可产生极强的免疫逃逸,并且这些中和抗体不能中和SARS-CoV。因此,筛选出中和SARS-CoV-2和SARS-CoV的广谱中和抗体对防控类似SARS-CoV-2和SARS-CoV等的β冠状病毒感染具有重要应用价值。本研究主要以SARS-CoV-2和SARS-CoV广谱性中和性抗体的筛选为目标,为后续广谱类中和抗体药物的开发提供一些思路。为此,我们制备了以SARS-CoV-2RBD为免疫原的m RNA疫苗对小鼠进行免疫,并诱导大量抗原特异性抗体的产生,再通过高通量单细胞测序技术构建出SARS-CoV-2特异性抗体库,从抗体库中我们合成并表达了出现频率最高的前100株单克隆抗体,通过基因座分析、结合效应分析、亲和力测定、中和活性评价以及阻断效应评价等方法,完成了抗SARS-CoV-2和SARS-CoV广谱中和抗体筛选的一系列工作。研究结果显示,利用SARS-CoV-2 RBD m RNA疫苗免疫可以快速诱导抗原特异性的抗体库产生,且该抗体库在基因座的使用上具有一定的聚焦性。我们从抗体库中选取了100株抗体进行基因合成并表达,从中我们筛选到能特异性结合SARS-CoV-2RBD的抗体有65株,能结合SARS-CoV-2 RBD和SARS-CoV RBD的抗体有8株。从这8株抗体中,我们筛选出2株能中和SARS-CoV-2和SARS-CoV的广谱中和抗体,分别为R30和R100抗体。其中,R30抗体可完全阻断两种病毒RBD蛋白与受体结合,R100抗体可完全阻断SARS-CoV-2 RBD与受体结合,可部分阻断SARSCoV RBD与受体结合。经过抗体表位竞争实验初步分析出R100中和抗体的结合表位可能与I类抗体的结合位点有很大重合,而R30中和抗体可能靶向于一个新的抗原表位。此外,我们还从这8株抗体中筛选到了包括R30和R100抗体在内的5株广谱中和SARS-CoV-2及其Delta变异株和Beta变异株的中和抗体,且均能够完全阻断SARS-CoV-2 RBD与受体结合。综上,本研究中利用高通量单细胞测序技术成功完成了SARS-CoV-2特异性抗体库的建库及测序工作,且通过这种大规模的筛选方式可筛选到2株中和SARS-CoV-2和SARS-CoV广谱中和抗体,尽管这两株抗体的中和活性不强,但后续通过抗体工程技术对其进行改造以及对其中和机制的深入研究将对未来广谱类疫苗及中和抗体的开发提供一些新的研究方向。

关键词： SARS-CoV-2 SARS-CoV B细胞抗体库广谱中和抗体

基于HIV广谱中和抗体A16和Y498的CAR-T构建

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基于HIV广谱中和抗体A16和Y498的CAR-T构建

作者：耿秀珠北京协和医学院

学位级别：硕士

研究目的自从第一位艾滋病患者发现以来,艾滋病已经对全世界人类的生命健康造成了重大威胁。虽然高效的联合抗逆转录病毒疗法(cART)能够有效地控制病毒的复制,降低了艾滋病患者的发病率以及死亡率,延长其生存时间,但是长期接受联合抗逆... 详细信息

研究目的自从第一位艾滋病患者发现以来,艾滋病已经对全世界人类的生命健康造成了重大威胁。虽然高效的联合抗逆转录病毒疗法(cART)能够有效地控制病毒的复制,降低了艾滋病患者的发病率以及死亡率,延长其生存时间,但是长期接受联合抗逆转录病毒疗法的AIDS病患者体内潜伏的HIV病毒会在停止服药后迅速反弹。与此同时,HIV基因极易产生突变从而导致耐药株的产生,使得目前药物治疗效果变差,必须不断开发新药进行治疗。此外,由于药物自身存在的毒副作用以及病毒感染导致的免疫细胞的耗破等,我们迫切需要探索更安全有效的抗病毒治疗方法。近年来,CAR-T细胞疗法在B淋巴瘤和白血病的治疗中获得了巨大的成功。该疗法具备高亲和力、TCR(T细胞受体)独立以及MHC非限制的特点。嵌合抗原受体是通过融合胞外的靶向识别结合抗原的结构域,跨膜结构域以及胞内的T细胞激活信号结构域构成的。采用基因工程技术向效应T细胞中导入相应基因,该基因将在T细胞内表达,由此,该细胞具备了抗原特异性识别的能力。通过患者自体免疫细胞基因改造和再回输,从而特异性地杀死体内存在的相应的肿瘤细胞。已有一些研究证明,可以采用将天然的CD4分子中的抗原识别结合区或者是HIV特异性单链抗体的可变区(scFv)与CD8+T细胞的T细胞的活化区融合,构建特异性的抗HIV CAR-T细胞。这一细胞因相关分子的表达具有特异性地杀死表达HIV包膜蛋白的细胞的能力。嵌合抗原受体T细胞疗法在HIV治疗领域展现出广泛前景,表现出巨大潜力。本实验室前期通过噬菌体抗体筛选技术从我国流行株HIV感染者体内分离了两个单克隆HIV广谱中和抗体:A16和Y498(专利号:ZL 201310154423.4、ZL201110078167.6)。前期SPR实验表明,这两个抗体对HIV病毒的亲和力均高于VRC01,更适用于进行CAR-T构建。因此,在这项研究中,我们将以VRC01为对照,使用A16和Y498来进行CAR-T构建,并评估其杀伤效果。研究方法在本文中,我们使用来源于三个识别CD4结合位点的HIV广谱中和抗体(VRC01、A16和Y498)的scFv基序分别与第三代CAR分子模型中的胞内及跨膜结构域基序进行融合,再将其构建于第三代慢病毒载体,随后验证蛋白的表达并进行慢病毒包装,并通过慢病毒转导原代CD8+T细胞的方式完成三种CAR-T细胞的构建。通过将三种CAR-T细胞分别与表达HIV标准株HXB2和JRFL包膜蛋白的细胞系共培养,验证其杀伤活性。研究结果本研究中,成功构建了三种CAR分子并通过免疫荧光及Western Blot实验验证了三种CAR分子的蛋白表达,通过不断调整,逐步提高了慢病毒滴度,确定病毒活力,并成功转导CD8+T细胞。经过不同实验条件的探究进行了对稳定表达HIV包膜蛋白细胞系的杀伤等体外实验,结果表明基于A16和Y498的scFv构建的CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效果基本与VRC01相当。研究讨论我们的研究结果表明,基于本实验室筛选所得的广谱中和抗体A16和Y498的scFv基序构建CAR-T细胞具有极强的可行性,具有进一步研究的意义。我们进一步推测,两种CAR-T细胞同样能与已报道的基于VRC01的scFv构建的CAR-T细胞一样清除接受cART治疗的HIV感染者体内被重激活的潜伏感染储存库,值得进一步研究及优化。

关键词： HIV感染 CAR-T 广谱中和抗体功能性治愈