嵌合广谱中和抗体VRC01、N6、3BNC117的外泌体抗HIV感染研究

作     者：吕启航 

作者单位：武汉科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：顾潮江

授予年度：2023年

学科分类：1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 100401[医学-流行病与卫生统计学] 10[医学] 

主      题：抗HIV-1感染 广谱中和抗体 外泌体 中和活性 

摘      要：背景及目的:目前,艾滋病(AIDS)仍是一种对人类健康安全有重大威胁的传染病,利用现有药物不能对其彻底治愈且无有效疫苗。高效抗逆转录病毒疗法(HAART)是目前治疗采用的主要方法,该疗法通过把蛋白酶抑制剂与多种抗病毒的药物联合起来进行给药治疗,可以最大限度地抑制病毒的复制,但由于不能清除CD4T细胞中的HIV-1潜伏病毒库,因此患者需要终身服药。近年来研究者从HIV-1精英患者体内分离到了多个广谱中和抗体(broadly neutralizing antibody,b NAb),包括VRC01、N6、3BNC117等,这些b NAbs可以中和98%的HIV-1毒株,使用抗HIV-1 b NAbs的免疫疗法在抑制病毒感染的同时,可以提高感染细胞的清除率,且在动物实验和人体临床研究中被证明具有预防和治疗AIDS的作用,是功能性治愈AIDS最主要治疗方向。目前已有的b NAbs如VRC01、N6、3BNC117是通过结合HIV-1囊膜的gp120蛋白来捕获病毒,进而发挥抗HIV-1感染及清除病毒及其感染细胞的作用。外泌体(Exosome,EXO)是一种细胞来源的天然囊泡,它主要形成过程是通过质膜凹陷形成分选内涵体,然后形成多囊泡体,最后多囊泡体与质膜融合将其分泌到细胞外。EXO具有良好的生物相容性、非免疫原性和高稳定性,可以透过包括血脑屏障在内的绝大多数生物屏障系统,且外泌体膜修饰方式多样,因此其本身或作为载体正在被积极研究。本研究通过HEK 293F细胞表达VRC01、N6、3BNC117并加载跨膜区使b NAb嵌合在外泌体膜上,能够以外泌体为介导发挥b NAb的抗HIV-1感染作用。方法:在成功构建的HEK 293F蛋白表达系统的基础上,构建VRC01、N6和3BNC117表达质粒,并通过HEK 293F蛋白表达系统表达VRC01、N6和3BNC117,收集其细胞培养上清,利用超速离心法分离提取EXO。利用透射电子显微镜(TEM)、纳米粒子示踪分析技术(NTA)、蛋白免疫印迹(WB)、外泌体流式细胞术对其进行分析和鉴定。再通过加载CD28跨膜区氨基酸的基因编码序列(CD28 TM)、HIV-1囊膜蛋白跨膜区氨基酸的基因编码序列(HIV-1 TM)、VSV-G囊膜蛋白跨膜区氨基酸的基因编码序列(VSV-G TM)、EBOV囊膜蛋白跨膜区氨基酸的基因编码序列(EBOV TM)、Marburg囊膜蛋白跨膜区氨基酸的基因编码序列(Marburg TM)到VRC01重链表达质粒上,并筛选出使b NAb更多地嵌合在EXO上的跨膜区。将嵌合广谱中和抗体的外泌体与染料标记的抗人Ig G Fc段的流式抗体、抗人Ig G Fab段的流式抗体以及染料标记的HIV-1 gp120三聚体蛋白孵育结合后,通过流式细胞术分析,以此来探究b NAbs在EXO上的展示方式。最后通过嵌合b NAbs的EXO(EXO-b NAbs)与HIV-1的体外中和实验,验证EXO-b NAbs抗HIV-1感染的能力。结果:本研究成功利用超速离心法分离提取到EXO-b NAbs,并通过验证其标记蛋白和抗体蛋白,首次发现在HEK 293F蛋白表达系统成功表达VRC01时,会产生EXO-b NAbs。通过加载并比较五种不同跨膜区对EXO-b NAbs中和活力的影响,筛选出CD28 TM,它可以使更多的b NAb嵌合到EXO上。通过外泌体流式细胞术分析探究b NAbs在EXO上的展示方式,证明b NAb的Fab、Fd、Fc均展示在EXO膜外,其中Fc段在EXO是100%暴露。与HIV-1毒株NL4-TAA的体外中和实验验证了这种EXO-b NAbs具有中和活力,并发挥抗HIV-1感染的作用。结论:综上所述,本研究通过对分离提取的EXO进行分析鉴定,确定了超速离心分离提取EXO的方法。得到了HEK 293F细胞来源的EXO-b NAbs,并通过外泌体流式细胞术验证了b NAb的Fab、Fd、Fc嵌合在EXO膜外,其中Fc 100%暴露在EXO外。与NL-4 TAA的中和实验结果表明,这种EXO-b NAbs具有较好的抗HIV-1感染的能力。以上结论对于针对AIDS的抗体免疫疗法的优化提供了新的方向。