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平邑甜茶发根农杆菌介导转化体系构建与优化

果树学报 2024年第5期41卷 999-1008页

作者：周雪婷武凯凯崔蓝芳张坤玺白团辉史江莉焦健王苗苗刘昱赵玉洁万然郝鹏博郑先波河南农业大学园艺学院郑州450046 河南省园艺植物生物学国际联合实验室郑州450046

【目的】建立并优化平邑甜茶(Malus hupehensis Rehd.)幼苗简单、高效、快速的发根农杆菌转化体系。【方法】以不同苗龄的平邑甜茶幼苗为材料,使用携带GFP及GUS过表达质粒的发根农杆菌K599,通过注射法、活化菌液浸染及菌株涂抹方法侵染... 详细信息

【目的】建立并优化平邑甜茶(Malus hupehensis Rehd.)幼苗简单、高效、快速的发根农杆菌转化体系。【方法】以不同苗龄的平邑甜茶幼苗为材料,使用携带GFP及GUS过表达质粒的发根农杆菌K599,通过注射法、活化菌液浸染及菌株涂抹方法侵染平邑甜茶根颈部诱导毛状根,利用GFP荧光检测、GFP蛋白印迹检测、DNA检测和GUS染色方法进行转基因株系验证,同时对成功转化株系根、茎、叶组织的表达量进行分析,检测发根农杆菌在转化平邑甜茶株系中的迁移性。【结果】不同苗龄平邑甜茶幼苗诱导毛状根能力具有较大差异,其中三叶龄幼苗诱导毛状根率最高,为96%,五叶龄幼苗最高的毛状根诱导率为65%,以使用菌株涂抹方式转化植株的毛状根分布为最佳、毛状根诱导率为最高。发根农杆菌在成功转化株系中存在随机向地上部迁移的现象,并能够整合目的基因至叶片叶柄及部分主叶脉基因组中,但在培养30 d时无法通过蛋白印迹方式在蛋白水平上检测到蛋白信号。【结论】建立并优化了简单、高效的发根农杆菌介导的平邑甜茶转化体系,鉴定了发根农杆菌在转化株系中随机向地上部迁移规律,为发根农杆菌技术的进一步利用提供理论依据。

关键词：平邑甜茶发根农杆菌转化效率迁移性

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平邑甜茶离体快繁体系的建立

中国南方果树 2024年

作者：黄欣艳蒙小玉冯建文乔光吴亚维贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院/山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室贵州省农业科学院果树科学研究所

平邑甜茶(Malus hupehensis)作为砧木，被广泛应用于苹果生产。为进一步提高平邑甜茶的离体快繁效率，以平邑甜茶春季幼嫩新梢带芽茎段为外植体，探究不同外植体消毒方式、不同植物生长调节剂配比对组培苗增殖和生根培养的影响，建立平... 详细信息

平邑甜茶(Malus hupehensis)作为砧木，被广泛应用于苹果生产。为进一步提高平邑甜茶的离体快繁效率，以平邑甜茶春季幼嫩新梢带芽茎段为外植体，探究不同外植体消毒方式、不同植物生长调节剂配比对组培苗增殖和生根培养的影响，建立平邑甜茶离体快繁体系。结果表明，平邑甜茶新梢带芽茎段用75%酒精处理30 s+2%次氯酸钠溶液处理12 min的消毒效果较好，成活率达81.11%。最佳增殖培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA，增殖系数为7.09；最适生根培养基为1/2MS+0.15 mg/L NAA，该处理下的生根率为75.55%，平均根系数量和长度分别为3.23条、3.57 cm；生根后的组培苗在蛭石∶珍珠岩∶营养土质量比为1∶1∶1基质中的移栽成活率为90%。该离体快繁体系，为周年培育平邑甜茶砧木苗提供了技术支持。

关键词：平邑甜茶离体快繁外植体消毒增殖培养生根培养

平邑甜茶NCL基因对根系钙离子吸收和积累的调控

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平邑甜茶NCL基因对根系钙离子吸收和积累的调控

作者：宁源生山东农业大学

学位级别：硕士

细胞Ca动态平衡与植物生命活动密切相关,植物类Na/Ca交换蛋白(NCX-Like,NCL)是一类维持细胞Ca稳态的跨膜转运蛋白。本研究基于拟南芥NCL序列以及苹果、葡萄、草莓、桃和梨全基因组信息,分析了NCL家族特征,探讨平邑甜茶根系Mh NCL表达水... 详细信息

细胞Ca动态平衡与植物生命活动密切相关,植物类Na/Ca交换蛋白(NCX-Like,NCL)是一类维持细胞Ca稳态的跨膜转运蛋白。本研究基于拟南芥NCL序列以及苹果、葡萄、草莓、桃和梨全基因组信息,分析了NCL家族特征,探讨平邑甜茶根系Mh NCL表达水平与细胞Ca浓度变化的关系,并利用Mh NCL-1转基因烟草和瞬时过表达平邑甜茶根系、钙敏感荧光探针和非损伤微测技术(NMT),初步明确了Mh NCL-1基因在盐胁迫响应及Ca吸收积累和转运方面的功能。主要结果如下:1、NCL家族成员在进化中高度保守,苹果基因组中的4个Md NCL基因的启动子上均含有胁迫响应及激素应答相关的顺式作用元件,且在苹果各器官中均有不同程度的表达。2、依据Md NCL保守结构域,从平邑甜茶中确定出4个相应的Mh NCLs基因(Mh NCL-1、Mh NCL-2、Mh NCL-3和Mh NCL-4),其中Mh NCL-1、Mh NCL-3和Mh NCL-4的表达水平在Na Cl、Ca Cl、4℃、PEG、ABA和IAA处理下都基本呈现“下降—上升—下降—上升”的变化规律,而根系细胞Ca浓度在上述处理下呈现“升高—降低—小幅度升高—小幅度降低”的趋势变化,根系NCL基因表达与Ca浓度变化有密切关系。3、过表达Mh NCL-1基因明显降低烟草和平邑甜茶根系对高浓度Na Cl的敏感性,减少MDA的积累,从而降低高浓度Na Cl引起的细胞死亡和膜脂过氧化。4、Mh NCL-1基因过表达使烟草和平邑甜茶根系对高浓度Ca Cl表现出更高的敏感性,提高了高浓度Ca Cl处理下植株体内MDA的积累,促进了膜脂过氧化和细胞死亡。5、Mh NCL-1基因过表达使烟草和平邑甜茶根系的Ca积累量减少,且高浓度Na Cl显著降低根系Ca积累,而高浓度Ca Cl显著增加根系Ca积累。6、过表达Mh NCL-1基因显著提高烟草和平邑甜茶根系Ca通量,Ca通量恢复过程较快,且高浓度Na Cl促进外向的Ca通量,高浓度Ca Cl促进内向的Ca通量。

关键词：平邑甜茶 NCL基因非生物胁迫钙浓度钙吸收积累

褪黑素对盐碱胁迫下平邑甜茶幼苗生长的影响及其机制

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园艺学报 2023年第8期50卷 1697-1710页

作者：孙志娟刘文杰郑晓东袭祥利马长青刘晓丽王彩虹田义轲青岛农业大学园艺学院青岛农业大学果树遗传改良与生物技术实验室山东青岛266109 青岛农业大学生命科学学院山东青岛266109

为探究外源褪黑素(melatonin)对盐碱胁迫下平邑甜茶(Malushupehensis)幼苗生长的影响及其作用机制,以无融合生殖率达到94%的平邑甜茶幼苗为试材,设置3个处理:对照(Hoagland营养液)、盐碱胁迫[100 mmol·L^(-1)NaHCO_(3)︰NaCl=1︰1(摩尔... 详细信息

为探究外源褪黑素(melatonin)对盐碱胁迫下平邑甜茶(Malushupehensis)幼苗生长的影响及其作用机制,以无融合生殖率达到94%的平邑甜茶幼苗为试材,设置3个处理:对照(Hoagland营养液)、盐碱胁迫[100 mmol·L^(-1)NaHCO_(3)︰NaCl=1︰1(摩尔比)的Hoagland营养液]、盐碱胁迫+褪黑素(0.1 mmol·L^(-1)),15 d后测定幼苗鲜质量、干质量、叶绿素含量、光合速率、矿质元素含量、抗氧化酶活性、渗透物质含量、有机酸含量、内源激素含量以及相关基因的表达量。结果表明,外源褪黑素可以显著降低盐碱胁迫下平邑甜茶幼苗的萎蔫率,并有效提高了盐碱胁迫下植株的生物量和光合效率,同时提高了幼苗中可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸的含量来缓解渗透胁迫。另外,褪黑素通过增加细胞内有机酸含量和提高AHA家族基因表达量,增强了植株的耐盐碱性;通过调节钠离子转运基因(MhCHX15和MhSOS1)和钾离子转运基因(MhSKOR、MhNHX1、MhNHX2和MhNHX4)的表达,提高细胞质中的钾钠比值以维持离子稳态;并通过提高过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性和调节抗氧化酶基因(MhGPX6、MhpoxN1和MhPER65)的表达,减少盐碱胁迫产生的氧化损伤。此外,外源褪黑素还可通过与赤霉素、生长素、细胞分裂素和茉莉酸甲酯协同作用共同应答盐碱胁迫。综上,盐碱胁迫+0.1mmol·L^(-1)褪黑素处理通过调节离子平衡、渗透物质、抗氧化酶活性并协同其他内源激素来缓解盐碱胁迫对平邑甜茶幼苗造成的损伤。

关键词：苹果平邑甜茶盐碱胁迫褪黑素高pH胁迫渗透平衡氧化损伤

平邑甜茶MhSnRK1在番茄中超表达对种子萌发及幼苗生长的影响

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园艺学报 2018年第6期45卷 1185-1192页

作者：王贵芳于雯罗静静肖元松赵永飞陈晓璐彭福田山东省果树研究所山东泰安271000 山东农业大学园艺科学与工程学院作物生物学国家重点实验室山东泰安271018

为探讨蔗糖非发酵–1–相关蛋白激酶–1(SnRK1)对种子萌发及幼苗生长的调控作用,以超表达平邑甜茶MhSnRK1的番茄株系O-7、O-9和其野生型(WT)为试材,研究MhSnRK1对番茄种子萌发及幼苗生长发育的影响。结果表明,WT、O-7和O-9在MS培养基中... 详细信息

为探讨蔗糖非发酵–1–相关蛋白激酶–1(SnRK1)对种子萌发及幼苗生长的调控作用,以超表达平邑甜茶MhSnRK1的番茄株系O-7、O-9和其野生型(WT)为试材,研究MhSnRK1对番茄种子萌发及幼苗生长发育的影响。结果表明,WT、O-7和O-9在MS培养基中种子发芽率均为100%,在MS+100 mmol·L^(-1)海藻糖培养基中发芽率显著降低,分别为23.3%、70.3%和67.7%;在MS培养基中O-7和O-9的SnRK1活性分别比WT高12.1%和2.3%,在海藻糖培养基中WT、O-7和O-9比在MS培养基中分别降低41.5%、35.5%和27.5%,O-7和O-9仍高于WT,可见在一定范围内较高的SnRK1活性促进种子的萌发。播种后14 d,与其他培养基中相比,海藻糖培养基中幼苗主根的长度最短,其中WT显著短于O-7和O-9;幼苗下胚轴的伸长较MS培养基中明显受到抑制,且WT受抑制的程度更大;在海藻糖培养基中添加0.3 mg·g^(-1)的IAA,WT下胚轴伸长受到的抑制得到解除。播种后30 d,海藻糖培养基中,与O-7和O-9相比,WT表现为子叶平整肥厚,真叶发育良好,叶面积较大,叶绿素含量显著高于O-7和O-9。上述结果表明,平邑甜茶MhSnRK1在番茄中超表达调控种子的萌发及幼苗的生长;在一定范围内,较高的SnRK1活性促进种子的萌发、抑制幼苗主根和下胚轴的伸长,较低的SnRK1活性更有利于幼苗的生长发育。

关键词：平邑甜茶 MhSnRK1 番茄 SnRK1活性种子发芽率下胚轴

平邑甜茶MhCLC-c1和MhCLC-e2对氯化钠和缺氮胁迫的响应

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平邑甜茶MhCLC-c1和MhCLC-e2对氯化钠和缺氮胁迫的响应

作者：韩梦圆山东农业大学

学位级别：硕士

苹果是我国北方地区栽培面积最大、产量最高的水果,土壤盐渍化和氮肥施用不当是影响苹果生产的重要因素。引起土壤盐渍化的主要是氯化钠,在氯化钠胁迫中,除了钠离子外,氯离子(Cl)也起非常重要的作用。氯离子通道(CLCs)是一类阴离子转运... 详细信息

苹果是我国北方地区栽培面积最大、产量最高的水果,土壤盐渍化和氮肥施用不当是影响苹果生产的重要因素。引起土壤盐渍化的主要是氯化钠,在氯化钠胁迫中,除了钠离子外,氯离子(Cl)也起非常重要的作用。氯离子通道(CLCs)是一类阴离子转运蛋白,除了调控细胞Cl运输外,也调控其他阴离子(如硝酸根,NO)等的跨膜运输。本研究在苹果CLC基因家族鉴定出9个CLC成员的基础上,从平邑甜茶扩增出MhCLC-c1和MhCLC-e2两个基因,获得它们的转基因苹果愈伤组织和MhCLC-c1过表达的拟南芥,分析了这两个基因对NaCl和缺氮胁迫的响应。主要结果如下:1.苹果CLC基因家族的生物信息学分析在苹果基因组中鉴定得到的9个CLC基因家族成员,分别位于苹果基因组的6条染色体上,外显子数量4～22个,启动子上存在多个与逆境胁迫及激素响应相关的顺式作用元件,它们编码的蛋白均定位于细胞质膜上。系统进化树显示9个Md CLCs分为两个亚家族,亚家族I成员中除了Md CLC-c2外均存在保守区域Gx Gx PE、GKx GPxx H和Pxx Gx LF,亚家族II成员只存在保守区域GKx GPxx H。9个Md CLCs存在5～11个跨膜区域。2.MhCLC-c1响应盐胁迫,不响应缺氮胁迫以苹果砧木平邑甜茶c DNA为模板,克隆了氯离子通道基因MhCLC-c1,该基因编码778个氨基酸,进一步构建了MhCLC-c1的过表达和反义抑制载体,并将其转化到苹果愈伤组织;同时,将MhCLC-c1的过表达载体转化到拟南芥。NaCl胁迫下,MhCLC-c1过表达系的HO含量、MDA含量、细胞相对死亡率和Cl含量均显著低于野生型,而反义系的结果则相反。亚细胞定位结果显示MhCLC-c1蛋白定位于细胞质膜。这些结果表明,在NaCl胁迫下,苹果属植物可能通过上调MhCLC-c1的表达来降低细胞内Cl含量,从而减轻NaCl胁迫的伤害。转基因拟南芥的结果中也显示,MhCLC-c1的过表达能够减轻NaCl胁迫的伤害。在缺氮条件下,MhCLC-c1转基因愈伤组织和野生型的表型差异不明显,说明MhCLC-c1不响应缺氮胁迫。3.MhCLC-e2响应盐胁迫和缺氮胁迫以苹果砧木平邑甜茶c DNA为模板,克隆了氯离子通道基因MhCLC-e2,该基因编码786个氨基酸。将MhCLC-e2转入‘王林’苹果愈伤组织,获得3个MhCLC-e2过表达愈伤系。在NaCl胁迫下,3个MhCLC-e2过表达愈伤组织的生长状态和鲜重均比野生型差,说明MhCLC-e2过表达愈伤组织对NaCl敏感。在缺氮培养基中,3个转基因愈伤组织生长状态均好于野生型,鲜重高于野生型,硝态氮、亚硝态氮、铵态氮和总氮含量均低于野生型,氨基酸含量高于野生型,表明缺氮条件下MhCLC-e2可能会通过影响氮素含量进而促进愈伤组织的生长。

关键词：平邑甜茶 MhCLC-c1 MhCLC-e2 NaCl 缺氮

平邑甜茶GRAS家族成员MhSCL29基因的鉴定及其对硝酸盐的响应

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平邑甜茶GRAS家族成员MhSCL29基因的鉴定及其对硝酸盐的响应

作者：于婷婷山东农业大学

学位级别：硕士

氮素化肥为苹果生产做出了重要贡献,但不当施用也带来了利用率下降、成本增加和环境污染等问题。硝酸盐是氮素化肥的重要成员,平邑甜茶是一种优良苹果砧木,栽培苹果需要通过其砧木对硝酸盐做出反应。GRAS是植物特异转录因子,SCL29是GRA... 详细信息

氮素化肥为苹果生产做出了重要贡献,但不当施用也带来了利用率下降、成本增加和环境污染等问题。硝酸盐是氮素化肥的重要成员,平邑甜茶是一种优良苹果砧木,栽培苹果需要通过其砧木对硝酸盐做出反应。GRAS是植物特异转录因子,SCL29是GRAS家族SHR亚家族的成员,本研究在分析平邑甜茶对不同浓度硝酸盐差异反应的基础,对GRAS家族进行苹果全基因组分析,从平邑甜茶中鉴定出MhSCL29基因,并利用MhSCL29过表达愈伤组织和瞬时表达根系,分析硝酸盐处理下的生理生化变化,探讨平邑甜茶MhSCL29基因在硝酸盐响应的作用。主要结果如下:1.在含0 m M、0.15 m M、3 m M和15 m M硝酸盐的1/2Hoagland营养液处理下,平邑甜茶实生苗生物量、叶绿素和类胡萝卜素含量、主根和根系总长度、根系体积、根尖数及根系活力差异明显;随硝酸盐浓度增加,根系硝酸还原酶活性和谷氨酰胺合成酶活性逐渐增加,NRT1.1、NRT2.1和D27表达量逐渐下调。2.从苹果基因组(GDDH13)鉴定到78个具有GRAS特征结构域的GRAS转录因子序列,共有9对串联复制基因,38对节段复制基因,而且,78个Md GRASs基因全部含有光响应元件,其中,Md GRAS40(Md SCL29)含有生长素响应、昼夜节律控制、防御和应激反应、低温响应、茉莉酸甲酯响应、伤口响应、玉米醇溶蛋白代谢调控等相关的元件。3.从平邑甜茶中鉴定出GRAS家族中9个SHR亚组基因,除MhGRAS20和MhGRAS40(MhSCL29)外,大部分SHRs的转录水平在芽中较高,在根中较低,但根系中所有SHR亚族基因对不同浓度硝酸盐处理均有响应,其中,MhGRAS40(MhSCL29)的表达量随着硝酸盐浓度的升高而降低。4.平邑甜茶MhSCL29基因开放阅读框长度为1656 bp,编码553个氨基酸;利用瞬时转化烟草叶片技术,发现基因MhSCL29定位于细胞核。5.在独脚金内酯类似物GR24处理下,平邑甜茶根系中MhSCL29基因变化趋势与D27相似,并且氮吸收同化相关基因MhNRT1.1、MhNRT2.1、MhNR2、MhNIR、MhGS2、MhGOGAT的表达总体上调。6.苹果愈伤组织在含0 M、0.02 M、0.04 M和0.08 M硝酸盐的愈伤继代培养基上处理15d,在0.08 M硝酸盐处理下愈伤组织颜色更深,细胞活力显著降低;过表达MhSCL29苹果愈伤组织鲜重显著低于野生型,但细胞活力显著高于野生型。7.过表达MhSCL29提高不同硝酸盐处理下苹果愈伤组织硝态氮、亚硝态氮和铵态氮含量以及NR、NIR和GOGAT的活性,促进NR2、NIR、GS2和GOGAT基因的表达,干扰NRT1.1和NRT2.1表达,促进独脚金内酯合成的关键基因D27表达,抑制GS1.1和GS1.2表达,降低谷氨酰胺合成酶的活性。8.瞬时表达MhSCL29提高不同硝酸盐处理下平邑甜茶根系硝态氮、亚硝态氮和铵态氮含量以及NR、NIR和GOGAT活性,抑制GS活性,促进平邑甜茶根系D27、NRT1.1、NRT2.1、NR2、NIR、GS2和GOGAT表达,抑制GS1.1和GS1.2表达。

关键词：平邑甜茶生物信息学分析 MhSCL29 独脚金内酯硝酸盐

外源褪黑素对重茬胁迫下平邑甜茶幼苗元素吸收利用的影响

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果树学报 2023年第8期40卷 1572-1582页

作者：何晓龙刘怀特张纪冉尚雨薇周莎莎李中勇张学英徐继忠梁博文河北农业大学园艺学院河北保定071000

【目的】探究外源褪黑素(melatonin,MT)对重茬胁迫下平邑甜茶(Malus hupehensis Rehd.)矿质元素吸收利用和生长的调控效应。【方法】以平邑甜茶实生苗为材料,采用盆栽试验,研究根施200μmol·L^(-1)褪黑素溶液对重茬胁迫下平邑甜茶幼苗... 详细信息

【目的】探究外源褪黑素(melatonin,MT)对重茬胁迫下平邑甜茶(Malus hupehensis Rehd.)矿质元素吸收利用和生长的调控效应。【方法】以平邑甜茶实生苗为材料,采用盆栽试验,研究根施200μmol·L^(-1)褪黑素溶液对重茬胁迫下平邑甜茶幼苗根、茎和叶中10种矿质元素含量、吸收、转移积累及分配的影响。【结果】外源褪黑素提高了重茬胁迫下平邑甜茶植株各部分干生物量,改变了各部分元素的含量,并且显著提高了植株对大量元素和微量元素的吸收,提升了各元素在根茎叶中分布的比例。Mantel检验结果表明,平邑甜茶植株中各矿质元素与各部分干质量均呈正相关。【结论】重茬胁迫下外源施用200μmol·L^(-1)褪黑素不仅能调控矿质元素的吸收和积累,还能促进植株生长。

关键词：平邑甜茶褪黑素重茬胁迫养分吸收

平邑甜茶生长素响应因子MhARF2基因克隆与表达分析

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植物生理学报 2019年第2期55卷 194-202页

作者：姜倩倩曹慧张保仁张慧玲潍坊学院山东省高校生物化学与分子生物学重点实验室山东潍坊261061 梁山县农业局

采用RT-PCR技术克隆得到平邑甜茶(Malus hupehensis)生长素响应因子基因MhARF2,该基因开放阅读框(ORF)2 532 bp,编码843个氨基酸残基。基因结构分析表明,MhARF2包含13个内含子和14个外显子;进化分析表明,MhARF2属于ARF2成员,与苹果(Malu... 详细信息

采用RT-PCR技术克隆得到平邑甜茶(Malus hupehensis)生长素响应因子基因MhARF2,该基因开放阅读框(ORF)2 532 bp,编码843个氨基酸残基。基因结构分析表明,MhARF2包含13个内含子和14个外显子;进化分析表明,MhARF2属于ARF2成员,与苹果(Malus domestica)、白梨(Pyrus bretschneideri)、甜樱桃(Prunus avium)ARF2具有较高的同源性;MhARF2含有ARF家族特有的B3 DNA结合域、CTD结构域和Auxin-resp结构域;MhARF2定位于细胞核;MhARF2启动子区域含有光响应元件、生长素应答元件和MeJA响应元件、ABA响应元件等多个顺式作用元件。qRT-PCR结果表明,MhARF2在平邑甜茶叶、根、茎、花和果实中均表达,其中叶片中表达水平最高,根次之。30 mg·L^(-1) IAA处理下,MhARF2在根中的转录水平受到诱导,6 h时最高;在100mmol·L^(-1)NaCl和200 mmol·L^(-1)甘露醇处理下,根系中MhARF2转录水平均随胁迫时间的延长先上升后降低,这说明MhARF2可能参与调控平邑甜茶生长素信号转导以及渗透胁迫响应的过程。

关键词：平邑甜茶 MhARF2 基因克隆序列分析表达分析