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遗传 2004年第6期26卷 793-796页

作者：林俊堂李玉昌张会勇徐存拴新乡医学院细胞生物学教研室新乡453003 河南师范大学生命科学学院新乡453002

抽提常氏肝癌细胞的总RNA ,以oligo(dT)为引物 ,通过两次转换模板 ,采用LD PCR合成全长cDNA ,在cDNA两端引入SfiⅠ的酶切位点。以λTriplEX2为载体经过包装后构建了常氏肝癌细胞cDNA表达文库。以ADAMs通用抗体 ,用免疫筛选技术从常氏肝... 详细信息

抽提常氏肝癌细胞的总RNA ,以oligo(dT)为引物 ,通过两次转换模板 ,采用LD PCR合成全长cDNA ,在cDNA两端引入SfiⅠ的酶切位点。以λTriplEX2为载体经过包装后构建了常氏肝癌细胞cDNA表达文库。以ADAMs通用抗体 ,用免疫筛选技术从常氏肝癌cDNA文库中筛选出 2 2个阳性克隆 ,经测序分析和BLAST检索 ,证实其中一个为新基因 ,部分区域具有蛋白酶的功能 ,对该基因进行了GenBank登录 ,获注册号为AY0 780 70。

关键词：常氏肝癌细胞 cDNA文库 ADAMs抗体免疫筛选基因克隆同源检索

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常氏肝癌细胞cDNA文库的构建及质量分析(英文)

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新乡医学院学报 2004年第1期21卷 1-4页

作者：林俊堂王聪睿张会勇李玉昌徐存拴新乡医学院细胞生物学教研室河南新乡453003 新乡医学院生物化学教研室河南新乡453003 河南师范大学生命科学学院河南新乡453002

目的　利用 RNA转录 5′末端转换机制 (SMART)构建适合免疫筛选的经去分化培养基处理的常氏肝癌细胞 c DNA文库。方法　通过反转录 PCR和长距离 PCR获得常氏肝癌细胞的全长 c DNA,然后利用 SMART c DNA文库构建试剂盒建立经去分化培养... 详细信息

目的　利用 RNA转录 5′末端转换机制 (SMART)构建适合免疫筛选的经去分化培养基处理的常氏肝癌细胞 c DNA文库。方法　通过反转录 PCR和长距离 PCR获得常氏肝癌细胞的全长 c DNA,然后利用 SMART c DNA文库构建试剂盒建立经去分化培养基处理的常氏肝癌细胞c DNA文库。结果　通过测定 ,高质量的包含常氏肝癌细胞全长 c DNA的 c DNA文库得到建立 ,扩增 c DNA文库的滴度高达 4.5× 10 10 pfu· ml- 1,重组子内平均插入外源基因片段长度在 2 0 0 bp到 40 0 0 bp之间 ,约 150 0 bp左右 ,并且此文库适合免疫筛选。结论　结果显示所构建的经去分化培养基处理的常氏肝癌细胞 c DNA文库具有很高的质量 ,为进一步研究常氏肝癌细胞和筛选相关基因获得 c

关键词： cDNA文库 RNA转录5′末端转换机制常氏肝癌细胞长距离PCR 免疫筛选

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ADAMs相关基因在肝癌细胞中的表达及功能分析

ADAMs相关基因在肝癌细胞中的表达及功能分析

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作者：林俊献新乡医学院

学位级别：硕士

背景ADAMs家族成员属于I型跨膜蛋白,具有相似的基本结构,都含有去整合素和金属蛋白酶功能结构域,与细胞外基质的降解,细胞-细胞的黏连,细胞-基质的黏连及信号转导等多种细胞功能有关。虽然对ADAMs家族的功能已经有很多了解,但是由于其... 详细信息

背景ADAMs家族成员属于I型跨膜蛋白,具有相似的基本结构,都含有去整合素和金属蛋白酶功能结构域,与细胞外基质的降解,细胞-细胞的黏连,细胞-基质的黏连及信号转导等多种细胞功能有关。虽然对ADAMs家族的功能已经有很多了解,但是由于其结构复杂,成员众多且组织分布具有特异性,仍需要进一步研究。目的构建去分化处理的常氏肝癌细胞(一种人源肝癌细胞)的c DNA文库,免疫筛选并克隆与分化相关的ADAMs基因,并初步研究其功能。方法*** blot方法检测DM(去分化培养基)处理的常氏肝癌细胞中蛋白表达的变化。2.构建DM处理的常氏肝癌细胞c DNA文库。3.用通用抗体对文库进行免疫筛选,克隆基因全长并测序分析。4.构建ARP1的原核表达载体,用SDS-PAGE和Western blot方法分析ARP1的功能。5.用蛋白水解酶复性电泳及SDS-PAGE分析大鼠的包括肝在内的17种组织器官的ADAMs的组成及蛋白图谱和蛋白水解酶谱。结果1.与未经处理的常氏肝癌细胞相比,DM处理的常氏肝癌细胞出现了30k D、50k D和105k D三种ADAMs。其中30k D和50k D ADAMs为DM所诱导。2.经检测,成功构建了DM处理的常氏肝癌细胞的c DNA文库。3.用ADAMs通用抗体对文库进行了免疫筛选和基因全长克隆,测序分析并注册了4个物种特异性的与ADAMs相关的基因。4.成功构建了ADAM相关基因1(ARP1)的原核表达载体,用活性电泳、Western blot方法分析发现,ARP1表达产物具有偏碱性蛋白水解酶活性,可降解明胶,并且可以和ADAMs通用抗体结合。5.通过分析不同组织器官的ADAMs的分布及蛋白图谱和蛋白水解酶谱,结果显示ADAMs的分布及酶活具有很大差异。结论本研究通过DM处理常氏肝癌细胞,构建c DNA文库并进行表达文库免疫筛选等方法,初步验证了DM处理可以诱导常氏肝癌细胞合成30k D和50k D ADAMs;构建的c DNA文库质量达标,可用性强;建立了切实可行的表达文库免疫筛选方法;注册了4个物种特异性的与ADAMs相关基因;构建了ADAMs相关基因1(ARP1)的原核表达载体,表达产物具有偏碱性蛋白水解酶活性,可以和ADAMs通用抗体结合。在不同组织器官中,ADAMs的分布及酶活具有很大差异。以上结果为进一步研究ADAMs及其相关基因的功能提供了重要资料。

关键词： ADAMs相关基因常氏肝癌细胞 c DNA文库

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