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中国生物化学与分子生物学报 2007年第2期23卷 141-146页

作者：石亚伟陈云霞崔丽方袁静明教育部化学生物学与分子工程重点实验室

为了研究一个新环酰亚胺水解酶（CIH）C端区残基对酶分子构象及酶活性的影响，设计了C末端缺失1～4个氨基酸残基以及C-末端2个Lvs替代为2个Glu或2个Leu的突变酶，以野生型酶基因重组质粒pE—cih293为模板，在相应引物存在下，通过PCR扩... 详细信息

为了研究一个新环酰亚胺水解酶（CIH）C端区残基对酶分子构象及酶活性的影响，设计了C末端缺失1～4个氨基酸残基以及C-末端2个Lvs替代为2个Glu或2个Leu的突变酶，以野生型酶基因重组质粒pE—cih293为模板，在相应引物存在下，通过PCR扩增获得突变的CIH基因片段．经克隆、表达与纯化，得到不同的突变酶蛋白．酶活性测定、荧光光谱与CD谱分析表明，随着C-末端缺失残基的增多，酶活性丧失也越来越多，但酶分子的聚合状态未发生变化；当CIH的C末端2个Lys替代为2个Glu时，酶活性及分子结构变化均不明显，但当替代为2个Leu时，酶活性丧失殆尽，分子结构变得松散而不再保持寡聚态．pH及热稳定性实验也表明。酶的稳定性与其分子的完整性密切相关．结果证实，CIH的C末端电荷残基对该酶活性与分子状态具有重要作用．

关键词：环酰亚胺水解酶 C-末端区带电荷氨基酸分子构象稳定性

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疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶催化活性的分子改造

疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶催化活性的分子改造

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作者：唐敏源云南师范大学

学位级别：硕士

疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL)由于具有热稳定性好、催化活性高、耐碱性等特点,在生物柴油、洗涤剂、食品、化妆品、皮革、医药和环境等领域作为工业催化剂应用广泛。然而,工业生产对脂肪酶的活性和耐受... 详细信息

疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL)由于具有热稳定性好、催化活性高、耐碱性等特点,在生物柴油、洗涤剂、食品、化妆品、皮革、医药和环境等领域作为工业催化剂应用广泛。然而,工业生产对脂肪酶的活性和耐受性有着极其严苛的要求,对TLL进行性质的优化能够克服其应用瓶颈,降低其生产成本。为了提高TLL的催化活性等性质,本研究利用计算机辅助设计和点饱和突变技术以及定点突变技术对TLL的催化活性及稳定性进行分子改造,产生的TLL突变体被证明具有良好的催化活性并且能够很好的应用到生物柴油工艺中。1.我们利用半理性设计,通过点饱和突变技术对TLL进行分子改造。选取TLL上的三个氨基酸位点(G23,D62,D96)进行三点饱和突变,完成了5760个突变体的筛选,得到12个酶活提高的的突变体。(1)通过分析突变体的性质,我们发现TLL的第96位氨基酸与其催化活性和酶学性质关系紧密,且G23,D62,D96这三个位点的复合突变可以获得酶学性质更加丰富的突变体。(2)且突变体G23A/D62K/D96H、D62R/D96E、D96Q、D96M、D96K、D62T/D96R的最适pH变为10.0;D62T/D96R、G23V/D96R、G23L/D62V的最适温度升高为60℃;G23T/D96R在80℃下处理45min,相对剩余酶活为47.3%,热稳定性较TLL有所提高;D96M、D96K的pH稳定区间较TLL变宽;D96M、D96K、G23L/D62V、G23V/D96R对底物的亲和力和催化效率均高于TLL。2.我们利用Rosetta软件的ddgonomer模块进行单位点饱和突变计算,预测稳定性能够得到提高的TLL突变体。对预测结果进行总结、分析后我们发现TLL表面带电氨基酸极具影响TLL稳定性的潜力,因此我们对TLL带电氨基酸D111、D158、D165、R205、R209、R232、E239、D254位点进行定点突变。(1)结果发现4个带负电氨基酸D111、D158、D165和E239位点的突变能产生催化活性提高的突变体,并且相对应的生物柴油的转酯率有显著提高。结构学分析发现这4个带负电的氨基酸D111、D158、D165和E239远离活性中心,将其突变为其它氨基酸时TLL的表面静电势会受到影响,致使TLL产生性质丰富的脂肪酶突变体。其中,TLL突变体D165E的催化活性和热稳定性较野生型TLL均有提高,且对生物柴油的转酯率高达93.56%。(2)突变体D111E、D158F、D158H、D165E最适温度提高为60℃;D165A和R209D在80℃下处理45min,相对剩余酶活降为50%左右,其热稳定性较TLL有一定提高;D158H、D164E、R232E、E239R、D254R的pH稳定性提高;R232F、D165A、E239R对底物的亲和力和催化效率均高于TLL。综上,通过理性设计和半理性设计对TLL进行分子改造,我们获得了催化活性、热稳定性、生物柴油转化率均有所提高的TLL突变体,这些突变体有潜力成为工业界,尤其是生物质能源领域的新产品,同时,我们的分子改造方法也将为相关研究提供新思路。

关键词：脂肪酶点饱和突变 Rosetta ddgmonomer 定点突变带电荷氨基酸生物柴油

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突变型环酰亚胺水解酶的分子构象与底物专一性

突变型环酰亚胺水解酶的分子构象与底物专一性

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作者：陈云霞山西大学

学位级别：硕士

环酰亚胺水解酶(Cyclic imide hydrolase，CIH，EC.3.5-2.16)，是一类报道甚少的环酰胺酶类，在细菌、真菌与霉菌中分布广泛。目前，有关CIH的报道主要有三例，分别来自于Blasterbacter sp．A17-4、Alcaligelies eatrophus 112R4和Pseudomonasputida YZ-26。其中，来源于Pseudomonas putida YZ-26的CIH293为我室专利。CIH的亚基分子量约为35 kDa，其功能单位为四聚体，它的作用底物主要是简单的环酰亚胺。CIH催化水解如琥珀酰亚胺等简单环酰亚胺类底物开环生成相应的酰胺酸，后者再在半酰胺酶的作用下生成相应的二元羧酸，最后进入TCA循环。为研究环酰亚胺水解酶(CIH293) C-端区残基对酶分子构象及酶活性的影响，设计了C-末端缺失1～4个氨基酸残基以及C-末端两个Lys替代为两个Glu或两个Leu的突变酶，以野生型酶基因重组质粒pE-cih为模板，在相应引物存在下，通过PCR扩增获得突变的CIH基因片段，并将它们分别插入到pE32M载体中，构建的重组质粒分别导入工程菌Ecoil BL21(DE3)，经诱导表达后进行菌体酶活性分析，随着C-末端缺失残基的增多，酶活性丧失也越来越多，CIH292、CIH291丧失约20％的活性，CIH290丧失约85％的活性，CIH289丧失全部活性;而KK292，293EE保留约80％的活性，KK292，293LL丧失90％以上的活性。根据细胞酶活性测定结果，选择CIH291、CIH290、KK292，293EE、KK292，293LL进行纯化，经Ni—NTA agarose亲和层析和Sephacryl S—200分子排阻层析获得的突变酶达到了电泳纯。重组野生型酶与突变型酶酶活性测定、寡聚体形式、荧光光谱与CD谱分析表明，随着C-末端缺失残基的增多，酶活性丧失也越来越多，但酶分子的聚合状态未发生变化，仍为同源四聚体;当CIH的C-末端两个Lys替代为两个Glu时，酶活性及分子结构变化均不甚明显，但当替代为两个Leu时，酶活性丧失殆尽，分子结构变得松散而不再保持寡聚态。pH及热稳定性实验也表明，酶的稳定性与其分子的完整性密切相关。结果证实CIH的C-末端电荷残基对该酶活性与分子状态具有重要作用。采用比色法与反相高效液相色谱法(RP-HPLC)分析了重组野生型酶与突变型酶的底物专一性和动力学参数。通过对环酰亚胺类底物与其相应产物的紫外扫描选择了适宜监测波长，流动相采用水和甲醇的混合液作为洗脱系统，在水和甲醇按不同比例混合后，各底物与其相应产物均获得了良好的分离效果。对底物专一性的分析显示，突变型酶与重组野生型酶相比，底物专一性未发生显著改变，最适底物仍为琥珀酰亚胺;然动力学参数测定结果表明，突变型酶对最适底物的亲和力略有降低，导致反应速度减小。可见，酶活性的丧失是由于C-端残基缺失或替代影响了酶对最适底物的亲和力使反应速度降低所致。

关键词：环酰亚胺水解酶突变型酶分子构象带电荷氨基酸底物专一性

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